В исследовании, опубликованном в Cell Stem Cell, исследователи использовали модифицированную версию CRISPR, называемую CRISPR Interference (CRISPRi), для инактивации генов в ИПСК и сердечных клетках, созданных из ИПСК. Этот метод, о котором впервые сообщил в 2013 году Стэнли Ци, доктор философии, соавтор настоящей статьи, значительно улучшает исходную систему CRISPR-Cas9, позволяя заглушать или отключать гены более точно и эффективно. CRISPRi также предлагает гибкость обращения и тщательного контроля степени подавления генов.Стандартная система CRISPR использует белок Cas9 для удаления определенной части генома, делая небольшие разрезы в ДНК клетки.
CRISPRi основывается на этой технологии, используя специальную деактивированную версию белка Cas9 и дополнительный белок-ингибитор, KRAB. Вместе эти белки сидят в целевом пятне генома и подавляют экспрессию генов, не разрезая ДНК.
К удивлению ученых, временное подавление экспрессии генов таким способом было гораздо более последовательным, чем постоянное расщепление генома.«Мы были поражены резкой разницей в производительности между двумя системами», — сказал старший автор Брюс Конклин, доктор медицины, старший исследователь Института сердечно-сосудистых заболеваний Гладстона и Центра стволовых клеток Родденберри в Гладстоне. «Мы думали, что постоянное разрезание генома будет более эффективным способом заглушить ген, но на самом деле CRISPRi настолько точен и так прочно связывается с геномом, что на самом деле это лучший способ заглушить ген».
В ходе исследования исследователи сравнили, насколько хорошо CRISPRi и CRISPR-Cas9 подавляют определенный ген, который контролирует плюрипотентность ИПСК — способность ИПСК превращаться в несколько типов клеток. Они обнаружили, что CRISPRi был намного более эффективным, чем CRISPR-Cas9: более чем в 95% клеток, созданных с использованием CRISPRi, целевой ген был заглушен, по сравнению только с 60-70% клеток, выращенных из CRISPR-Cas9. CRISPRi также не вызывал каких-либо нецелевых изменений в экспрессии генов, таких как нежелательные вставки или делеции в геном клетки, что является проблемой для CRISPR-Cas9.CRISPRi также действовал как тумблер, позволяя ученым отменить подавление гена, просто удалив химическое вещество, которое включает ингибитор гена.
Кроме того, исследователи смогли настроить, насколько они заглушили ген, изменив количество добавляемых химикатов. Оба эти результата подтверждают гораздо более разносторонние исследования роли определенных генов, влияющих на развитие и болезни.Исследователи продемонстрировали расширенные возможности CRISPRi в ИПСК, Т-клетках и клетках сердца, сделанных из стволовых клеток.
Например, они создали модель сердечного заболевания, используя редактирование генома для подавления гена, необходимого для работы сердца.«CRISPRi имеет большое преимущество в создании типов клеток, имеющих отношение к заболеванию», — сказал первый автор исследования Мохаммад Мандегар, доктор философии, научный сотрудник Gladstone. «Используя эту технологию, мы можем имитировать болезнь в гомогенной популяции сердечных клеток, созданных из ИПСК.
Эта разработка позволяет нам легче изучать генетические заболевания и потенциально определять новые терапевтические цели».