Международная группа исследователей под руководством Периклиса Пантазиса, профессора кафедры биосистемных наук и инженерии (D-BSSE) ETH Zurich в Базеле, объяснила этот двухфазный механизм переключения цвета. Ученые называют это «преждевременным преобразованием». Новые знания позволяют исследователям модифицировать другие светочувствительные белки, чтобы они также могли возбуждаться в двух фазах.В миллисекундах
Исследователи из ETH Zurich, Технологического института Карлсруэ и Исследовательского кампуса Janelia в Эшберне, штат Вирджиния, внимательно изучили белки, активированные синим светом, и смогли показать, что эти белки переходят в возбужденное состояние, продолжающееся несколько миллисекунд. «Это относительно долго», — объясняет Пантазис. «Другие явления флуоресценции намного короче».Ученые также смогли показать, что это состояние является случаем явления, известного из квантовой химии, — «триплетного состояния».
Примерно через пять миллисекунд флуоресцентный белок Dendra 2 возвращается в свое основное состояние. Преобразование с праймированием происходит только в том случае, если вторая фаза — освещение ближним инфракрасным светом — происходит в пределах триплетного временного окна.Модифицированные аминокислотные последовательностиПродолжительность триплетного состояния сильно зависит от стабильности флуоресцентного белка.
Это, в свою очередь, зависит от точной последовательности строительных блоков белка (аминокислот), поэтому ученые изменили аминокислотную последовательность Dendra 2 в нескольких местах. Затем они сделали то же самое с другим флуоресцентным белком, Eos.
До сих пор этот белок нельзя было возбуждать в двух фазах. В научной литературе задокументировано, что эти местоположения важны для триплетного состояния.Ученые измерили продолжительность триплетного состояния со всеми новыми белками.
Это состояние было значительно расширено в нескольких протестированных белках. Ученые также смогли модифицировать белок Eos, чтобы он тоже мог активироваться в две фазы. Им удалось сделать это с другими шестью белками, которые раньше никогда не активировались в двух фазах. «Модифицированные белки не просто впервые сделали переключаемыми в две фазы; они также более стабильны и, следовательно, флуоресцируют более интенсивно», — говорит Мануэль Мор, докторант в группе Пантазиса и ведущий автор исследования.
Возможно с любым микроскопомУченые сделали оригинальное открытие с помощью лазера, который обычно не используется, используя свет в ближнем инфракрасном диапазоне. Однако сегодня ученые продемонстрировали, что этого эффекта можно достичь с помощью тех же обычных красных лазеров, что и в каждом флуоресцентном микроскопе.
Другими словами, примированное преобразование возможно с любым флуоресцентным микроскопом.Преобразование с грунтовкой можно использовать в микроскопии, чтобы отметить узкую точку в образце ткани. Ученые делают это, направляя синий и красный лазерный луч в ткань так, чтобы лучи пересекались в одной точке.
Преобразование с грунтовкой происходит только на этом пересечении. «Поскольку ни синий, ни красный лазерный свет не обладают токсическим действием, этот метод идеально подходит для живых организмов», — говорит Пантазис. Возможны также приложения с другими методами микроскопии, включая микроскопию сверхвысокого разрешения, которая существует уже несколько лет.Картирование мозга и секвенирование генов«Теперь мы знаем, как модифицировать фотопреобразованные белки, чтобы заставить их переключаться в две фазы», - говорит Пантазис. Исследователи запатентовали это открытие.
Ученые ETH работают вместе с экспертами по белкам, чтобы таким же образом модифицировать другие флуоресцентные белки, используемые в микроскопии.Исследователи недавно модифицировали белки, чтобы их можно было отделить от активирующего гены мессенджера таким образом, чтобы они могли быть активированы светом с помощью двух цветов. Например, они могут освещать ткань синим и красным лучом, пересекающимся в одной точке, что позволяет активировать определенные гены в одной клетке ткани.
Таким же образом можно модифицировать белки, которые обнаруживают кальций, и потенциально их можно использовать для трехмерного картирования мозга.В конечном итоге биологи могут использовать новую технику для других функциональных анализов в 3D: ETH Zurich уже выдал несколько лицензий на патент, в том числе для стартапа, который планирует разработать метод секвенирования ДНК с использованием 3D-матрицы.
