Подход является быстрым, очень гибким, эффективным и масштабируемым, что позволяет команде изучать множество генов одновременно или исследовать большие области генома. Путем конструирования мутаций непосредственно у взрослых мышей и, таким образом, обхода необходимости создания трансгенных животных, этот метод может быстрее давать результаты и, в некоторых случаях, более точно имитировать биологические процессы, протекающие при раке человека.Рак — это заболевание ДНК, при котором в раковой клетке развиваются сотни или тысячи мутаций, что мешает попыткам секвенирования ДНК отличить мутации, вызывающие рак, от мутаций-пассажиров, которые являются побочными эффектами развития рака.
Кроме того, многие гены рака трудно обнаружить путем секвенирования, например, потому что они не мутированы, а не регулируются другими способами при раке. Еще одна важная задача — определить функцию мутировавших генов в нормальных клетках и понять, как их мутация вызывает рак.CRISPR / Cas9 — это метод, который позволяет исследователям нацеливать мутации на любую позицию в геноме, отключая один или несколько генов.
Однако применение этой технологии в модельных организмах все еще находится в зачаточном состоянии. В этом исследовании команда использовала CRISPR / Cas9, чтобы вызвать мутации в клетках печени взрослых мышей, чтобы спровоцировать развитие рака печени. При примерно 800 000 новых случаев в год рак печени занимает шестое место в мире по распространенности.«Мы рассудили, что, воздействуя на мутации непосредственно на взрослые клетки печени с помощью CRISPR / Cas9, мы могли бы лучше изучить и понять биологию этого важного рака», — говорит доктор Матиас Фридрих, автор статьи из Wellcome Trust Sanger Institute. «Другие подходы к созданию мутаций у мышей, такие как манипуляции со стволовыми клетками, ограничены трудоемким процессом, длительными временными рамками и большим количеством животных.
И наш метод лучше имитирует важные аспекты биологии рака человека, чем многие« классические ». мышиные модели: как и в большинстве случаев рака человека, мутации происходят у взрослых и затрагивают лишь несколько клеток ».Команда исследователей составила список из восемнадцати генов с известными или неизвестными доказательствами их важности в двух формах рака печени. Они ввели молекулы CRISPR / Cas9, нацеленные на различные комбинации этих генов, мышей.
В течение нескольких месяцев у мышей развился рак печени или желчных протоков.«Наш подход позволяет нам одновременно воздействовать на несколько предполагаемых генов в отдельных клетках», — говорит профессор Роланд Рад, руководитель проекта в Техническом университете Мюнхена и Немецком центре исследования рака в Гейдельберге. «Теперь мы можем быстро и эффективно проверять, какие гены вызывают рак, а какие — нет. И мы можем изучить, как гены работают вместе, вызывая рак — ключевую часть головоломки, которую мы должны решить, чтобы понять болезнь и бороться с ней. "Этот подход подтвердил, что набор белков, называемых ARID, которые влияют на организацию хромосом, важны для развития рака печени.
Мутации во втором белке, TET2, оказались причиной рака желчных протоков: хотя при раке желчных протоков человека мутации TET2 не обнаружено, белки, с которыми он взаимодействует, были обнаружены, что свидетельствует о том, что метод CRISPR / Cas9 может идентифицировать гены рака человека, которые не мутировали, но функция которых нарушена другими событиями.«Новые инструменты нацеливания на гены в сочетании и индукции вставок или делеций в хромосомах меняют нашу способность выявлять новые вызывающие рак гены и понимать их роль в развитии рака», — говорит профессор Аллан Брэдли, старший руководитель группы и почетный директор Института Сэнгера. . «Наши результаты показывают, что этот подход осуществим и продуктивен при раке печени; теперь мы продолжим изучать наши новые открытия и попытаемся распространить этот подход на другие типы рака».Подход команды CRISPR / Cas9 также перспективен для биологической эксплуатации геномных пустынь — областей человеческого генома, которые, по-видимому, лишены генов.
Недавние исследования, такие как проект ENCODE, предполагают, что пустыни могут быть заселены если не генами, то регуляторными участками ДНК, которые влияют на активность генов.«Рак печени имеет много изменений ДНК в регионах, в которых отсутствуют гены: мы не знаем, какие из них могут быть важны для болезни», — объясняет Роланд Рад. «Мы могли бы показать, что теперь можно удалять такие области, чтобы систематически определять их роль в развитии рака печени».
Новый подход команды позволит им изучить важность других пустынь, удалив их с помощью CRISPR / Cas9 и изучив последствия для биологии клеток, тканей и животных.