Однако подготовка объектов для SEM и других распространенных методов визуализации может поставить под угрозу хрупкие биологические образцы. Сублимационная сушка материала, электронные лучи и вакуумное давление в микроскопе могут привести к повреждению клеток, что проблематично для визуализации формы, размера и развития клеток. Кроме того, подготовка материала для просмотра под микроскопом с использованием SEM требует специального оборудования, что снижает производительность и ложится большим финансовым бременем на научные лаборатории.
Исследователи из Университета Флориды разработали новые методы для менее разрушительного, более экономичного и высокопроизводительного подхода к визуализации клеточной структуры. «Для визуализации клеток разнообразного растительного материала, — объясняет исследователь Джейкоб Лэндис, — существуют альтернативы широко используемому SEM. Некоторые из этих альтернатив могут быть более доступными для исследователей и не требуют специального оборудования для обработки перед визуализацией. "Лэндис и его коллеги создали протоколы для метода 3D-реконструкции оптических сечений, в котором используется составной флуоресцентный световой микроскоп. Составной микроскоп имеет несколько линз для отражения света и проецирования изображения с большим увеличением. Микроскоп и установленная камера «срезают» растительные клетки, делая снимки нескольких слоев и плоскостей исследуемого материала.
Изображения реконструируются в окончательное трехмерное изображение с таким же более высоким разрешением, что и изображения, полученные с использованием SEM.Ландис разработал новый протокол (подробно описанный в недавнем выпуске Applications in Plant Sciences), чтобы видеть клетки эпидермиса на поверхности лепестков цветов.
Эта группа клеток открывает обширную информацию генетикам, агрономам и экологам. Эпидермальные клетки цветов вызывают все типы изменений на клеточном уровне, которые могут увеличиваться, чтобы влиять на цвет и развитие цветов, а также на экологические взаимодействия, такие как успех растения в привлечении опылителей и избегании врагов насекомых.В отличие от SEM, материал, который будет отображен с помощью нового метода, сохраняется, что позволяет получить четкое изображение через несколько месяцев после сбора любых образцов. Это ценно, когда исследования требуют массовой обработки образцов.
Затем материал обезвоживается в этаноловом спирте, погружается в жидкость, чтобы удалить восковую пленку, которая защищает внешний слой лепестковых клеток, и помещается во флуоресцентный краситель, чтобы помочь визуализировать детали под микроскопом.Катализатором этого метода послужило более крупное исследование клеточных и генетических основ размера цветков группы лесных растений Saltugilia. Растения Saltugilia имеют широкий диапазон размеров цветков и содержат все типы опылителей, включая колибри, пчел и пчелиных мух, в то время как некоторые растения не содержат опылителей вообще.
СЭМ не может быть использован для понимания этих разнообразных цветов, потому что он ограничен образцами размером 3-5 мм. Новый подход к 3D-реконструкции оптических сечений позволяет получать изображения образцов размером до 5 см перед разрезанием лепестков и нарушением ячеистой структуры лепестков.
Оптическое сечение и трехмерная реконструкция были неофициально протестированы на другом растительном материале, включая клетки листьев и репродуктивные органы (тычинки, пыльники и чашелистики). «Мы считаем, что любой вид ткани, которую можно разместить на предметном стекле микроскопа, можно будет отобразить», — говорит Ландис. «Я потратил много времени на использование SEM и подготовку образцов, и оптическое сечение с 3D-реконструкцией — это, безусловно, самый простой и самый экономичный метод, который я когда-либо использовал».