С помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и рентгеновской кристаллографии была получена структурная информация о ферменте в его закрытом состоянии — информация, то есть информация о точном моменте, когда фермент особенно биохимически активен. Особый трюк был необходим, чтобы облегчить структурный анализ закрытого состояния фермента в первую очередь.
Результаты исследования, которые предоставляют важную информацию о биохимических механизмах, которые управляют энергетическим бюджетом клеток, были опубликованы в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS).
Фермент аденилаткиназа открывается и закрывается, как у моллюска: он открывается, чтобы получить лиганд, и закрывается, чтобы «обработать» его биохимически. После этого он снова открывается, чтобы высвободить его и принять следующий лиганд.
Это происходит 340 раз в секунду — слишком быстро, чтобы отобразить отдельные этапы процесса с помощью структурного анализа. Для структурных биологов получение информации о закрытом состоянии фермента именно в той точке процесса, где наблюдаются пики биохимической активности, имеет огромное значение.
Профессор Майкл Коверманн, младший профессор магнитно-резонансной спектроскопии в Университете Констанца, нашел способ сделать это возможным. Он ввел дисульфидную связь как своего рода «химическую нить», чтобы заставить фермент принять закрытую форму и удержать его в этом состоянии.
Фермент остается именно в этом положении, что позволяет исследователям анализировать его с помощью ЯМР-спектроскопии и рентгеновской кристаллографии. Коверманн впервые смог получить изображения точного момента, когда фермент обрабатывает лиганд биохимически.
Двумя годами ранее ему уже удалось сделать структурные изображения фермента в его открытом состоянии и с уже установленным лигандом. «Прелесть в том, что теперь мы можем отображать как лиминальные состояния, так и делать структурные данные общедоступными», — говорит Коверманн.
Его уловка по улавливанию фермента в закрытом состоянии теперь может быть использована в дальнейших исследованиях. Состояние фермента можно контролировать, связывая или удаляя дисульфидную связь.
Анализ Коверманна уже показал, что сродство фермента к реакции — химическое притяжение между ферментом и его лигандом — увеличивается во много раз в его закрытом состоянии, тогда как его продуктивный оборот снижается с той же скоростью. Другими словами: химическая активность между лигандом и ферментом особенно высока в закрытом состоянии. Но оборот уменьшается, потому что лиганд не может выйти из закрытой «раскладушки», что означает, что через фермент проходит меньше лигандов.
Коверманн также смог доказать, что структурная динамика аденилаткиназы сильно зависит от взаимодействия между ферментом и лигандом.е. при наличии или отсутствии лиганда. Для этого он сравнил закрытое состояние фермента для обоих вариантов, с захваченным лигандом и без него.
Если лиганд отсутствует, динамика закрытого фермента остается неизменной по сравнению с его открытым состоянием. Однако, как только лиганд присутствует, могут наблюдаться заметные изменения. «Такое поведение противоречит интуиции, это не то, чего можно было бы ожидать», — объясняет Майкл Коверманн. «Только благодаря ЯМР-спектроскопии мы смогли задокументировать этот удивительный результат."