CRISPR-Cas12a, один из белков, расщепляющих ДНК, совершивших революцию в современной биологии, обладает неожиданным побочным эффектом, который делает его идеальным ферментом для простой, быстрой и точной диагностики заболеваний.Cas12a, открытый в 2015 году и первоначально называвшийся Cpf1, похож на хорошо известный белок Cas9, который Дженнифер Дудна из Калифорнийского университета в Беркли и ее коллега Эммануэль Шарпантье превратили в мощный инструмент редактирования генов в 2012 году.CRISPR-Cas9 позволил ускорить биологические исследования всего за шесть лет, ускорив изучение причин болезней и породив множество потенциальных новых методов лечения.
Cas12a был важным дополнением к набору инструментов для разрезания генов, способным разрезать двухцепочечную ДНК в местах, которые Cas9 не может, и, поскольку он оставляет рваные края, возможно, его легче использовать при вставке нового гена в разрез ДНК.Но соавторы Дженис Чен, Энбо Ма и Лукас Харрингтон в лаборатории Дудны обнаружили, что, когда Cas12a связывает и разрезает целевую двухцепочечную последовательность ДНК, он неожиданно вызывает беспорядочное разрезание всей одноцепочечной ДНК в пробирке.Большая часть ДНК в клетке имеет форму двухцепочечной спирали, поэтому это не обязательно проблема для приложений редактирования генов. Но это позволяет исследователям использовать одноцепочечную «репортерную» молекулу с белком CRISPR-Cas12a, который производит однозначный флуоресцентный сигнал, когда Cas12a находит свою цель.
«Мы по-прежнему восхищаемся функциями бактериальных систем CRISPR и тем, как понимание механизмов открывает возможности для новых технологий», — сказал Дудна, профессор молекулярной и клеточной биологии и химии и исследователь Медицинского института Говарда Хьюза.Исследователи Калифорнийского университета в Беркли вместе со своими коллегами из Калифорнийского университета в Сан-Франциско опубликуют свои выводы 15 февраля через службу ускоренного просмотра журнала Science, First Release.Исследователи разработали диагностическую систему, которую они назвали ДНК-эндонуклеазами CRISPR Trans Reporter, или DETECTR, для быстрого и легкого обнаружения даже небольших количеств ДНК в клинических образцах прямо у врача.
Он включает добавление всех реагентов в одной реакции: CRISPR-Cas12a и его целевой последовательности РНК (направляющая РНК), флуоресцентной репортерной молекулы и системы изотермической амплификации, называемой амплификацией рекомбиназной полимеразы (RPA), которая аналогична полимеразной цепной реакции (ПЦР). При нагревании до температуры тела RPA быстро увеличивает количество копий целевой ДНК, повышая шансы, что Cas12a найдет одну из них, свяжется и раскроет одноцепочечную ДНК, что приведет к флуоресцентному считыванию.Исследователи Калифорнийского университета в Беркли протестировали эту стратегию на образцах пациентов, содержащих вирус папилломы человека (ВПЧ), в сотрудничестве с лабораторией Джоэла Палефски в Калифорнийском университете в Сан-Франциско. Используя DETECTR, они смогли продемонстрировать точное обнаружение типов ВПЧ «высокого риска» 16 и 18 в образцах, инфицированных множеством различных типов ВПЧ.
«Этот белок работает как надежный инструмент для обнаружения ДНК из различных источников», — сказал Чен. «Мы хотим раздвинуть границы этой технологии, которая потенциально применима в любой диагностической ситуации, когда есть компонент ДНК, включая рак и инфекционные заболевания».Беспорядочное разрезание всей одноцепочечной ДНК, которое, как обнаружили исследователи, справедливо для всех родственных молекул Cas12, но не для Cas9, может иметь нежелательные эффекты в приложениях для редактирования генома, но по этой теме необходимы дополнительные исследования, сказал Чен.
Например, во время транскрипции генов клетка на короткое время создает отдельные цепи ДНК, которые могут случайно разрезаться Cas12a.
Активность белков Cas12 аналогична активности другого семейства ферментов CRISPR, Cas13a, которые пережевывают РНК после связывания с последовательностью РНК-мишени. Различные команды, в том числе команда Дудны, разрабатывают диагностические тесты с использованием Cas13a, которые могут, например, обнаружить геном РНК ВИЧ.Эти новые инструменты были изменены из их первоначальной роли в микробах, где они служат адаптивной иммунной системой для отражения вирусных инфекций.
В этих бактериях белки Cas хранят записи о прошлых инфекциях и используют эти «воспоминания» для выявления вредоносной ДНК во время инфекций. Cas12a, белок, использованный в этом исследовании, затем разрезает вторгающуюся ДНК, спасая бактерии от захвата вирусом.По словам Чена, случайное открытие необычного поведения Cas12a подчеркивает важность фундаментальных исследований, поскольку они исходили из простого любопытства по поводу механизма, который Cas12a использует для расщепления двухцепочечной ДНК.«Круто, что, рассмотрев вопрос о механизме расщепления этого белка, мы обнаружили то, что мы считаем очень мощной технологией, полезной во множестве приложений», — сказал Чен.
Дополнительными соавторами статьи являются студентка Синьран Тиан из Калифорнийского университета в Беркли, а также Мария Да Коста и Джоэл Палефски из UCSF. Работа поддержана в первую очередь Национальным научным фондом.