Этот подход отличается от других методов, поскольку он не требует совместной доставки фермента, называемого эндонуклеазой, для закрепления ДНК реципиента в определенных местах. Он также не полагается на совместную вставку генетических переключателей, называемых промоторами, для активации экспрессии нового гена.Эти различия могут сделать новый подход более безопасным и долговечным.
Используя эту технику, исследователи из Стэнфорда смогли вылечить мышей с гемофилией, вставив ген фактора свертывания крови, отсутствующий у животных.«Похоже, что мы сможем добиться непрерывной экспрессии встроенного гена, что особенно важно при лечении генетических заболеваний, таких как гемофилия и тяжелый комбинированный иммунодефицит», — сказал Марк Кей, доктор медицинских наук, профессор педиатрии и генетики. «Мы можем сделать это без использования промоторов или нуклеаз, что значительно снижает вероятность рака, который может возникнуть, если новый ген внедряется в случайные места в геноме».
Используя эту технику, Кей и его коллеги смогли вставить рабочую копию отсутствующего фактора свертывания крови в ДНК мышей с гемофилией. Хотя вставка была произведена только примерно в 1% клеток печени, эти клетки восполнили недостающий фактор свертывания в достаточном количестве, чтобы облегчить заболевание.Кей — старший автор исследования, которое будет опубликовано 29 октября в журнале Nature. Ведущий автор — докторант Ади Барзель, доктор философии.
Возможная альтернатива CRISPRСтэнфордское открытие может предложить альтернативу методу редактирования генома под названием CRISPR / Cas9, основанному на древней защитной реакции, разработанной бактериями для отражения вирусной атаки. Каждый раз, когда бактерия побеждает вирус, она сохраняет крошечную часть ДНК захватчика в своем собственном геноме, как генетическое перо в своей шапке. (Накопления этих вирусных областей называются сгруппированными с регулярными промежутками короткими палиндромными областями, или CRISPR.) Когда этот вирус появляется снова, клетка использует фрагменты сохраненного генетического материала для идентификации и фиксации совпадающих областей в вирусном геноме.
После присоединения он разрезает вирусные гены в определенных местах с помощью белка Cas9.Исследователи во всем мире начали использовать метод CRISPR / Cas9 не только для того, чтобы навсегда отключить гены для изучения у лабораторных животных, но и для вставки новых, модифицированных генов в геномы животных. Это позволяет быстро создавать генетически модифицированных лабораторных животных; то, что раньше занимало месяцы или годы, теперь может занять дни или недели.
Однако для этого метода требуется не только ген нуклеазы Cas9, который сам может интегрироваться в геном реципиента, но и промотор, управляющий экспрессией генов. Исследователи обеспокоены тем, что при использовании у людей Cas9 может разрезать ДНК в неожиданных местах, что может разрушить или убить клетку. С другой стороны, промотор нового гена может отрицательно повлиять на экспрессию близлежащих генов, вызывая рак или другие заболевания. Чужеродные бактериальные белки также могут вызывать иммунную реакцию у пациентов.
«Сайт-специфичное нацеливание на гены — одна из наиболее быстро развивающихся областей генной терапии и геномной инженерии», — сказал Барзел. «Но использование нуклеаз и промоторов может иметь серьезные побочные эффекты. Я хотел придумать новую схему нацеливания на гены, которая не включала бы переносимый вектором промотор и не требовала использования эндонуклеазы».В методе, разработанном исследователями, не используются ни нуклеазы для разрезания ДНК, ни промотор, управляющий экспрессией гена фактора свертывания крови. Вместо этого исследователи связывают экспрессию нового гена с экспрессией гена с высокой степенью экспрессии в печени, называемого альбумином.
Ген альбумина производит белок альбумина, который является наиболее распространенным белком в крови. Это помогает регулировать объем крови и позволяет молекулам, которые нелегко растворяются в воде, перемещаться в крови.
Исследователи использовали модифицированную версию вируса, обычно используемого в генной терапии, под названием аденоассоциированный вирус, или AAV. В модифицированной версии, называемой вирусным вектором, все вирусные гены удалены, и остаются только терапевтические гены.
Они также полагались на биологический феномен, известный как гомологичная рекомбинация, чтобы вставить ген фактора свертывания крови рядом с геном альбумина. Используя специальный ДНК-линкер между генами, исследователи смогли гарантировать, что белок фактора свертывания крови производится рука об руку с высокоэкспрессированным белком альбумина.Во время гомологичной рекомбинации, которая является естественным процессом восстановления, клетка пользуется преимуществом того факта, что у нее есть две копии каждой хромосомы.
Выстраивая поврежденные и неповрежденные хромосомы, клетка может спрятать неповрежденную копию, чтобы восстановить повреждение без потери жизненно важной генетической информации. Кей и Барзел использовали этот естественный процесс рекомбинации для копирования последовательностей вирусного вектора в геном в местах, обозначенных исследователями — в данном случае после гена альбумина.
Эффективен у новорожденных и взрослых мышей.Когда они протестировали свой подход на новорожденных лабораторных мышах с гемофилией, они обнаружили, что у животных начали проявлять уровни фактора свертывания крови от 7 до 20 процентов от нормы.
В предыдущих исследованиях было показано, что такое количество фактора свертывания оказывает терапевтическое действие на мышах. Кроме того, они неожиданно показали, что этот метод работает и у взрослых животных, хотя ген был успешно вставлен менее чем в 1 из каждых 100 клеток печени.«Мы ожидали, что этот подход лучше всего подойдет для новорожденных животных, потому что печень все еще растет», — сказал Кей, который также является профессором педиатрии семьи Денниса Фарри. «Однако, поскольку считалось, что гомологичная рекомбинация происходит в основном в пролиферирующих клетках, мы не ожидали, что она будет работать так же хорошо, как у взрослых животных».Кей много лет занимается генной терапией гемофилии.
В 2006 году он был руководителем группы исследователей, которые использовали AAV для предоставления гена фактора свертывания крови пациентам с гемофилией B. Эта форма гемофилии встречается реже, чем гемофилия A, которая поражает примерно 1 из 25000 новорожденных мальчиков (поскольку состояние вызвано дефектным геном на Х-хромосоме, у девочек он поражает редко). Однако гемофилия B является более легкой мишенью для лечения, потому что ген недостающего фактора свертывания меньше и легче поддается манипуляции с помощью генной терапии.Как и в случае со многими вирусами, существуют разные штаммы AAV. К сожалению, экспрессия фактора свертывания крови штаммом AAV, использованным в исследовании 2006 года, длилась всего несколько месяцев у людей, в отличие от долгоживущей экспрессии у животных.
Недавно в Соединенном Королевстве было запущено другое аналогичное клиническое испытание с использованием другого штамма AAV, и экспрессия фактора свертывания крови все еще наблюдалась у каждого из шести человек, пролеченных более чем через два года после получения модифицированного вируса. Однако в обоих этих испытаниях ген фактора свертывания крови не был вставлен в геном, а вместо этого сохранялся в виде отдельной свободно плавающей копии.
«Настоящая проблема с AAV заключается в том, что неясно, как долго продлится экспрессия гена, если ген не интегрирован в геном», — сказал Кей, который также является членом Стэнфордского института рака, Стэнфордского института исследований здоровья детей и Stanford Bio. X. «Младенцы и дети, которым лечение принесет наибольшую пользу, все еще растут, и неинтегрированный ген может потерять свою эффективность, потому что он не копируется из клетки в клетку.
Кроме того, невозможно повторно назначать лечение, потому что у пациентов развивается иммунный ответ на AAV. Но с интеграцией мы можем получить выражение на всю жизнь, не опасаясь рака или других повреждений ДНК ».
В настоящее время исследователи планируют протестировать эту технику на мышах с печенью, состоящей как из человеческих, так и из мышиных клеток, модель, которую они недавно смогли показать, может стать хорошим суррогатом для дальнейшего прогнозирования того, что произойдет с людьми.