Метод CRISPR-Cas9, изобретенный три года назад в Калифорнийском университете в Беркли, взял штурмом геномику благодаря своей способности захватывать очень специфическую последовательность ДНК и разрезать ее, с легкостью инактивируя гены. Это имеет большие перспективы для таргетной генной терапии для лечения генетических заболеваний и выявления причин болезней.Технологию также можно настроить так, чтобы она фиксировалась без разрезания и маркировки ДНК с помощью флуоресцентного зонда, который позволяет исследователям находить и отслеживать ген среди тысяч в ядре живой делящейся клетки.
Недавно разработанный метод теперь упрощает создание направляющих РНК, которые позволяют CRISPR-Cas9 так точно нацеливать ДНК. Фактически, при расходах менее 100 долларов любой может сделать десятки тысяч таких точно управляемых зондов, охватывающих весь геном организма.Процесс, который они называют CRISPR-EATING — для «Все доступное, превращено в новые руководства», описан в статье, которая будет опубликована в номере журнала Developmental Cell от 10 августа.В качестве доказательства принципа исследователи превратили весь геном обычной кишечной бактерии E. coli в библиотеку из 40 000 руководств по РНК, которые покрывают 88 процентов бактериального генома.
Каждое руководство по РНК представляет собой сегмент из 20 пар оснований РНК: шаблон, используемый CRISPR-Cas9, поскольку он ищет комплементарную ДНК для связывания и разрезания.
Эти библиотеки можно использовать в традиционном редактировании CRISPR-Cas9 для нацеливания на любую конкретную последовательность ДНК в геноме и ее разрезания, что и делают исследователи, чтобы определить функцию гена: выбить его и посмотреть, что плохого происходит в клетке. . Это может помочь, например, определить причину заболевания. Этот процесс называется генетическим скринингом и проводится партиями: каждый из тысяч зондов вводится в одну ячейку на планшете, заполненном сотнями тысяч клеток.«Мы можем сделать эти библиотеки за гораздо меньшие деньги, что делает генетический скрининг потенциально доступным для организмов, менее изученных», например, тех, чьи геномы еще не секвенировали, — сказал первый автор Эндрю Лейн, научный сотрудник Калифорнийского университета в Беркли. .Мониторинг ячеек в реальном времениНо Лейн и его коллега Ребекка Хилд, профессор молекулярной и клеточной биологии Калифорнийского университета в Беркли, разработали технологию для отслеживания хромосом в реальном времени в живых клетках, в частности, во время деления клеток, процесса, известного как митоз.
Это часть более крупного проекта Хилда по выяснению того, что регулирует размер ядра и других субклеточных компонентов при росте организмов от нескольких клеток до множества клеток.«Эта технология позволит нам нарисовать целую хромосому и посмотреть на нее вживую и действительно проследить за ней в ядре во время клеточного цикла или по мере того, как он проходит этапы развития, например, в эмбрионе, чтобы увидеть, как он изменяется в размере и структуре. , — сказал Хилд.
В новом методе используется стандартная ПЦР (полимеразная цепная реакция) для генерации многих коротких участков ДНК из любого интересующего исследователя сегмента ДНК, вплоть до всего генома. Затем эти фрагменты точно отрезаются в области, называемой PAM, которая имеет решающее значение для связывания CRISPR.
Затем с помощью простых рестрикционных ферментов отрезают каждый кусок на 20 пар оснований от конца PAM, создавая точный размер направляющей РНК, которую CRISPR использует для поиска в геноме комплементарных сайтов. Эти направляющие РНК затем легко включаются в комплекс CRISPR-Cas9, давая десятки тысяч зондов для мечения или разрезания ДНК.
«Используя сам геном в качестве источника направляющих РНК, их подход делает создание библиотек, нацеленных на смежные области, доступным практически для любой лаборатории», — сказал Джейкоб Корн, управляющий и научный директор Innovative Genomics Initiative в Калифорнийском университете в Беркли. «Это может быть очень полезно для визуализации генома и определенных видов экранов, и мне очень интересно увидеть, как это позволяет делать биологические открытия с помощью инструментов Cas9».