Но микроскопия сверхвысокого разрешения имеет большое ограничение: она предлагает только пространственное разрешение. Этого может быть достаточно для статических образцов, таких как твердые материалы или фиксированные клетки, но когда дело доходит до биологии, все становится сложнее. Живые клетки очень динамичны и зависят от сложного набора биологических процессов, которые происходят в субсекундных временных масштабах и постоянно меняются.
Поэтому, если мы хотим визуализировать и понять, как живые клетки функционируют при здоровье и болезнях, нам также необходимо высокое временное (или «временное») разрешение.Команда под руководством профессора Тео Лассера, руководителя лаборатории биомедицинской оптики (LOB) в EPFL, в настоящее время предприняла шаги для решения этой проблемы, разработав метод, который может выполнять как трехмерную микроскопию сверхвысокого разрешения, так и быстрое трехмерное фазовое изображение за один инструмент. Фазовая визуализация — это метод, который переводит изменения фазы света, вызванные клетками и их органеллами, в карты показателя преломления самих клеток.Уникальная платформа, которую называют «4D микроскопом», сочетает в себе чувствительность и высокое временное разрешение фазовой визуализации со специфичностью и высоким пространственным разрешением флуоресцентной микроскопии.
Исследователи разработали новый алгоритм, который может восстанавливать информацию о фазе из стопки изображений в светлом поле, полученных с помощью классического микроскопа.«С помощью этого алгоритма мы представляем новый способ достижения трехмерной количественной фазовой микроскопии с использованием обычного светлопольного микроскопа», — говорит Адриен Десклу, один из ведущих авторов статьи. «Это позволяет напрямую визуализировать и анализировать субклеточные структуры живых клеток без маркировки».Чтобы получить быстрое трехмерное изображение, ученые разработали специальную призму для разделения изображений, которая позволяет одновременно записывать стопку из восьми изображений со смещением по оси Z. Это означает, что микроскоп может выполнять высокоскоростную трехмерную фазовую визуализацию в объеме 2,5 × 50 × 50 мкм.
Скорость микроскопа в основном ограничена скоростью его камеры; для этой демонстрации команда смогла отобразить внутриклеточную динамику с частотой до 200 Гц. «С помощью призмы в качестве дополнения вы можете превратить классический микроскоп в сверхбыстрый 3D-формирователь изображений», — говорит Кристин Груссмайер, еще один из ведущих авторов статьи.Призма также подходит для трехмерной флуоресцентной визуализации, которую ученые протестировали с использованием визуализации оптических флуктуаций сверхвысокого разрешения (SOFI). Этот метод использует мерцание флуоресцентных красителей для улучшения трехмерного разрешения за счет корреляционного анализа сигнала.
Используя это, исследователи выполнили трехмерную визуализацию окрашенных структур в клетках со сверхвысоким разрешением и объединили ее с трехмерной фазовой визуализацией без меток. Эти две техники очень хорошо дополняли друг друга, открывая захватывающие изображения внутренней архитектуры, цитоскелета и органелл также в живых клетках в разные моменты времени.«Мы в восторге от этих результатов и возможностей, предлагаемых этим методом», — говорит профессор Хилал Лашуэль, чья лаборатория в EPFL объединилась сПрофессор Лассер использует новую технику для изучения механизмов, с помощью которых агрегация белков способствует развитию и прогрессированию нейродегенеративных заболеваний, таких как болезни Паркинсона и Альцгеймера. «Технические достижения позволили визуализировать с высоким разрешением формирование патологических агрегатов альфа-синуклеина в нейронах гиппокампа».
Команда назвала новую платформу микроскопии PRISM, что означает «Прибор для извлечения фазы с микроскопией сверхвысокого разрешения». «Мы предлагаем PRISM в качестве нового инструмента микроскопии и ожидаем, что он будет быстро использоваться в сообществе медико-биологических наук для расширения возможностей высокоскоростной трехмерной визуализации для биологических исследований», — говорит Тео Лассер. «Мы надеемся, что он станет постоянной рабочей лошадкой для нейробиологии и биологии».