В ходе исследования исследователи подтвердили, что этот белок, названный MurJ, переворачивает молекулу жира с одной стороны мембраны бактериальной клетки на другую. Если эту молекулу не перевернуть, клетка не сможет построить критический слой, который удерживает находящееся под давлением содержимое клетки.
Если это содержимое не содержится, ячейка взрывается.E. coli является частью семейства грамотрицательных бактерий, характеризующихся наличием дополнительной мембраны, называемой внешней мембраной, которая снижает вероятность проникновения лекарства в клетку и ее уничтожения.
Однако для подавления MurJ потребуется преодолеть только одну из двух мембран, что означает, что это может быть привлекательной новой мишенью для антибиотиков в наш век устойчивых патогенов.«У нас есть принципиальное доказательство того, что MurJ на самом деле является допустимой мишенью, потому что мы показали, что если мы остановим его работу, клетки умрут в течение 10 минут — очень быстро», — сказал Нативидад Руис, доцент микробиологии в Университете штата Огайо. и соавтор исследования.«Если вы хотите разработать антибиотик, важно знать функцию белка.
Определение активности, связанной с MurJ, — большой шаг вперед к возможной разработке антибиотиков, которые могли бы нацелить его».Руис руководил исследованием вместе с Томасом Бернхардтом, доцентом микробиологии и иммунобиологии Гарвардской медицинской школы. Исследование опубликовано в номере журнала Science от 11 июля 2014 г.Эта работа сосредоточена на попытке остановить образование слоя бактериальных клеток, называемого пептидогликаном, сетчатой структуры, которая у грамотрицательных бактерий, таких как кишечная палочка, находится между внутренней и внешней клеточными мембранами.
Без этого слоя клетки E. coli не могут выжить.Ученым давно известно большинство этапов создания этого слоя, который состоит из сахаров и аминокислот, сшитых друг с другом. Но одна деталь осталась неуловимой: какой белок может получить определенный липид, необходимый для построения слоя пептидогликана, чтобы изменить свое местоположение, от внутренней части внутренней мембраны к внешней стороне той мембраны, где происходит строительство пептидогликана.Липиды содержат жир и другие вещества и служат частью инфраструктуры клеточной мембраны.
Загадочный белок был назван флиппазой из-за его функции: переворачивания липидов.Около 25 лет назад другие группы ученых предложили два вероятных белка, которые выполняли эту роль, в зависимости от их местоположения в бактериальной клетке.
Было известно, что белки вносят вклад в создание пептидогликана, но их специфическая функция никогда не была продемонстрирована.Изучая клеточные мембраны в качестве постдокторского исследователя, Руис сузил вопрос о том, что белок MurJ может служить флиппазой E. coli.
Руис и его коллеги ранее показали, что MurJ имеет несколько особенностей, указывающих на эту возможность: модель его структуры показывает характерную полость, которая должна быть у флиппазы; устранение белка показало, что клетки не могут образовывать пептидогликановый слой; и было продемонстрировано, что это связано с другими переворачивающими белками.В этой новой работе лаборатории под руководством Руиса и Бернхардта объединились, чтобы предпринять дополнительные шаги, необходимые для подтверждения функции MurJ.Одним из важных шагов для Руиса была возможность остановить работу MurJ в клетках и увидеть немедленные эффекты этого торможения.
В большинстве подобных исследований ученые снижают уровень белка, подавляя активацию генов, производящих этот белок, что требует времени и не обязательно полностью устраняет присутствие белка.Вместо этого лаборатория Руиса использовала синтетическое химическое вещество для связывания с горячими точками на MurJ в клетках способами, которые немедленно останавливали функционирование белка.«Идея состоит в том, чтобы подавить белок, а затем — бум — проанализировать его и посмотреть, останавливаете ли вы переворачивание», — сказал Руис. «Это эквивалентно использованию антибиотика, который убивает белок, не позволяя ему работать, когда он связывается».Затем лаборатория Бернхардта разработала способ дальнейшего тестирования эффектов ингибирования MurJ.
Исследователи использовали токсин, выделяемый некоторыми клетками, который, как известно, «съедает» перевернутый липид вскоре после того, как он появляется на внешней стороне его внутренней мембраны, эффективно останавливая строительство пептидогликана.В нормальных клетках очень мало целевого липида можно было обнаружить, когда токсин был введен в клетки, что означает, что липид перевернулся и немедленно потреблялся токсином.
Но когда MurJ был подавлен в этих клетках и был добавлен токсин, ученые обнаружили накопление липидов, которые токсин не мог съесть, а это означает, что липид никогда не менялся, потому что активность MurJ исчезла.«Мы показали, что эти клетки умрут, если мы подавляем MurJ, и мы показали, что MurJ необходим для того, чтобы произошло переворачивание.
Если клетки умирают из-за того, что переворачивание не происходит, то никто другой эту работу не выполняет. Сказал Руиз, объяснив, что MurJ — загадочный тупик.