В основе системы, разработанной в лаборатории члена Уайтхеда Терри Орр-Уивера, лежат фолликулы яичников дрозофилы — уникальный тип клеток, репликация ДНК которых жестко регулируется во время развития организма. Контролируемый характер репликации в этих клетках позволил Орр-Уивер и ее лаборатории манипулировать аспектами процесса, чтобы обнаружить места двухцепочечных разрывов (DSB), их вероятную причину и механизмы, с помощью которых клетки пытаются восстановить.
Система описана в последнем выпуске Current Biology.«Мы знаем, что неправильная регуляция репликации может привести к изменению количества копий, и фон состоит в том, что есть изменения в количестве копий ДНК в раковых клетках», — говорит Орр-Уивер, который также является профессором биологии Американского онкологического общества.
Массачусетский технологический институт. «Мы знаем, что нерегулируемая репликация ведет к нестабильности генома, но никто не мог реально взглянуть на это напрямую».В случае успеха репликация ДНК передает генетический материал от материнской к дочерним клеткам (как это происходит во время деления митотических клеток) или увеличивает количество копий ДНК в клетках тканей, которые зависят от множественных копий генома для увеличения размера.
В исследованных здесь клетках процесс повторной репликации (также называемый амплификацией) происходит в шести специфических сайтах, известных как DAFC (для ампликонов дрозофилы в клетках фолликулов). Двулучевые структуры, известные как репликационные вилки, образуются в DAFC и перемещаются по двухцепочечной ДНК, раскручивая ее, создавая две одиночные цепи для копирования.Хотя ученые предполагали, что DSB возникают, когда вилки репликации — движение которых Орр-Уивер сравнивает с поездом, движущимся по железнодорожному пути ДНК — сталкиваются друг с другом, никто этого не продемонстрировал.
Пока не знаю. Используя комбинацию технологий визуализации и секвенирования, Орр-Уивер и ее лаборатория обнаружили, что DSB возникают в местах остановки репликационных вилок, почти наверняка из-за коллизии.«Благодаря разрешающей способности этой системы мы теперь можем знать, где находятся вилки относительно того, где происходят разрывы», — говорит Джессика Александер, аспирантка лаборатории Орр-Уивера и первый автор Current Biology. бумага.
Александер и Орр-Уивер также обнаружили, что DSB необходимо отремонтировать, чтобы вилка продолжала работать. Однако способ ремонта оказался несколько удивительным. Разрывы ДНК исправляются одним из двух способов: первый, известный как негомологичное соединение концов (NHEJ), происходит быстро, но подвержен ошибкам; вторая, гомологичная рекомбинация (HR), занимает больше времени, но гораздо точнее.
Учитывая важность точной репликации, можно предположить, что HR будет выбранным методом восстановления. Изменяя различные механизмы контрольных точек в путях репарации ДНК, исследователи обнаружили, что клетки вместо этого полагаются на быстрые и грязные NHEJ для исправления DSB и поддержания движения вилок повторной репликации.
Скорость, кажется, имеет решающее значение.«Негомологичное соединение концов примерно в 14 раз быстрее, чем гомологичная рекомбинация», — отмечает Александр. «Клетки фолликулов не заботятся об использовании пути мутагенного восстановления, потому что они отслаиваются от ооцита дрозофилы в конце амплификации. Любые возникающие мутации не повлияют на организм».
Имея эту новую систему в руках, Орр-Уивер и ее лаборатория могут начать изолировать отдельные компоненты, участвующие в путях восстановления, определить их точные роли и, возможно, определить, вовлечены ли в процесс другие участки генома.«Это действительно дает нам фундаментальные знания, чтобы двигаться вперед, механически глядя на то, что клетка использует для восстановления разрывов», — говорит она. «Возможно, то место, где это происходит в геноме, может повлиять на способ восстановления ДНК».