В процессе, аналогичном железнодорожной системе, в которой поезда следуют скоординированному графику остановок, клетки используют запрограммированную остановку вилки, чтобы остановить механизм репликации в заранее определенных местах вдоль цепи ДНК, называемых участками терминатора. Сайты терминаторов минимизируют столкновение между механизмами репликации и механизмами транскрипции, перемещающимися по одному и тому же пути ДНК, блокируя оба процесса на остановленной вилке.
В противном случае столкновение могло бы привести к разрыву цепи ДНК или ее нестабильности. Запрограммированная остановка вилки также предотвращает постоянную работу механизмов репликации и транскрипции, что помогает сохранить количество энергии, необходимой клетке для функционирования.Эти меры контролируют продолжительность жизни клеток и сохраняют стабильность генома, по словам Дипака Бастии, доктора философии, заведующего кафедрой биомедицинских исследований Департамента биохимии и молекулярной биологии MUSC и соавтора исследования.
«Запрограммированная остановка вилки связывает репликацию ДНК со старением, транскрипцией и дифференцировкой генов», — говорит Бастия. «Вы должны поддерживать геном, чтобы сохранить генетическую целостность и продолжительность жизни».Во время репликации и транскрипции ДНК полимеразы ДНК перемещаются по двойной спирали.
Во время репликации один фермент, геликаза, раскручивает двухцепочечную ДНК на две одноцепочечные цепи, которые перемещаются позади нее по мере ее движения. ДНК-полимеразы служат матрицами для каждой отдельной цепи, обеспечивая синтез двух двухцепочечных дочерних копий из одной родительской цепи ДНК.
Соединение, в котором двухцепочечная ДНК разделяется на две одинарные цепи, удачно называется вилкой.Только большие белки, называемые гистонами, которые прочно связываются с ДНК, гарантированно останавливают репликационную вилку на ее пути.
Механизм репликационной вилки легко убирает с пути другие связанные с ДНК белки. В каком-то смысле этот процесс поддерживает плавное перемещение репликации по цепи ДНК. Но для точной настройки своего жизненного цикла клеткам нужна более точная мера остановки репликации, кроме объемных гистонов.
Оказывается, белок под названием Fob1 находится на участках терминатора ДНК и работает с перерывами, чтобы остановить развитие вилки, подобно воротам. Его биохимический сигнал — фосфорилирование.Именно этот процесс разработали Бастия и его коллеги. DDK, одна из двух основных киназ, зависящих от клеточного цикла, которые определяют, в какой фазе жизни находится клетка, отвечает за сборку блокировки репликационной вилки на участках терминатора, где связан Fob1.
Во время активной репликации механизм репликации легко выталкивает Fob1 с дорожки ДНК и продолжает проходить мимо участков терминатора. Однако, когда DDK фосфорилирует геликазу, которая раскручивает двухцепочечную ДНК в головке вилки, он инициирует образование посадочной площадки на основе белка, которая соединяется с геликазой. Загадочный белок под названием «Timeless» затем стыкуется с посадочной площадкой и сдерживает другие геликазы, которые обычно сметают Fob1 с участков терминатора ДНК перед движущейся вилкой. Затем вентиль Fob1 останавливает вилку репликации, как запрограммировано.
Группа Бастии показала это на дрожжах, генетически инактивировав компонент DDK, который отвечает за фосфорилирование геликазы. В экспериментах по микроскопии «расчесывания хромосом», где одноцепочечные и двухцепочечные ДНК были помечены флуоресцентными молекулами разного цвета и осторожно растянуты на покровные стекла, инактивированный DDK не смог остановить репликационную вилку. Когда активный DDK был заблокирован от фосфорилирования геликазы, белок Timeless не мог достичь посадочной площадки, и вилка репликации продолжала работать без ограничений.
По словам Бастии, эта физиологическая программа, сходная для многих организмов, вероятно, будет сохраняться и у людей.Бастия заявляет, что это новое понимание послужит основой для исследований старения.
Расшифровка способов продления запрограммированной остановки вилки в здоровых клетках может в конечном итоге продлить продолжительность здоровой жизни человека. «Старение — это болезнь, — говорит он, — а не естественный процесс».