«GUIDE-seq — это первый общегеномный метод точного обнаружения разрывов ДНК вне мишени, вызванных нуклеазами CRISPR-Cas, который не начинается с предположения, что эти сайты вне мишени похожи на сайты-мишени», — говорит Дж. Кейт Джунг. Доктор медицинских наук, заместитель начальника отдела исследований отделения патологии МГЗ и старший автор отчета. «Эта возможность, которой раньше не было, критически важна для оценки любого клинического использования CRISPR-Cas RGN».
CRISPR-Cas RGN, используемые для разрезания двойной цепи ДНК с целью внесения генетических изменений, объединяют бактериальный фермент, расщепляющий ген, называемый Cas9, с коротким сегментом РНК, который совпадает с целевой последовательностью ДНК и связывается с ней. В статье Nature Biotechnology 2013 года Джунг и его коллеги сообщили, что обнаружили, что CRISPR-Cas RGN могут также вызывать двухцепочечные разрывы (DSB) в сайтах, которые значительно отличаются от сайта-мишени, включая несовпадения целых пяти нуклеотидов.
Поскольку такие нецелевые мутации потенциально могут привести к побочным эффектам, включая рак, способность идентифицировать и в конечном итоге минимизировать нежелательные DSB будет иметь важное значение для безопасного клинического использования этих RGN, отмечают авторы.Разработанный ими метод включает использование коротких двухцепочечных олигонуклеотидов, которые захватываются DSB в ДНК клетки, действуя как маркеры разрывов вне мишени, вызванных использованием CRISPR-Cas. Эти теги позволяют идентифицировать и последующее секвенирование этих геномных областей, точно определяя местоположение мутаций, не соответствующих цели.
Эксперименты с GUIDE-seq показали, что он достаточно чувствителен для обнаружения нецелевых сайтов, на которых CRISPR RGN вызывают нежелательные мутации гена, которые возникают с частотой всего 0,1 процента в популяции клеток. Эти эксперименты также показали, что, поскольку многие такие мутации произошли на сайтах, весьма отличных от целевого сайта, никакие простые правила не позволят предсказать количество или местоположение нецелевых DSB.Два существующих инструмента, разработанные для прогнозирования мутаций вне мишени путем анализа целевой последовательности, были намного менее эффективны, чем GUIDE-seq, в прогнозировании подтвержденных сайтов, не являющихся мишенью, а также ошибочно идентифицированных сайтов, которые, как оказалось, не были разрезаны ферментом. Сравнение GUIDE-seq с инструментом под названием ChIP-seq, который определяет сайты, где белки связываются с цепью ДНК, подтвердило, что ChIP-seq не обеспечивает надежного метода для идентификации индуцированных CRISPR-Cas DSB.
GUIDE-seq также смог идентифицировать горячие точки в контрольных клеточных линиях, которые не были индуцированы для экспрессии CRISPR RGN. «В различных статьях ранее описывались хрупкие участки генома в клетках человека, — отмечает Джунг, — но этот метод может быть первым, который идентифицирует эти участки без добавления лекарств, которые усиливают возникновение таких разрывов. Мы также были удивлены, обнаружив эти разрывы. происходили в основном в разных участках двух клеточных линий, использованных в этом исследовании. Способность фиксировать эти независимые от RGN разрывы предполагает, что GUIDE-seq может быть полезным инструментом для изучения и мониторинга репарации ДНК в живых клетках ».Кроме того, GUIDE-seq смог проверить, что разработанный MGH подход для повышения точности CRISPR-Cas путем сокращения направляющего сегмента РНК снижает количество DSB по всему геному.
Юнг также ожидает, что GUIDE-seq будет полезен при выявлении нецелевых разрывов, вызванных другими инструментами редактирования генов. Наряду с рассмотрением этой возможности, он отмечает важность исследования частоты и обнаружения нецелевых мутаций в человеческих клетках, не измененных для создания клеточных линий — процесса, который превращает их в бессмертные раковые клетки. Понимание диапазона и количества нецелевых мутаций в нетрансформированных клетках даст лучшее представление о том, как CRISPR-Cas RGN и другие инструменты будут работать в клинических приложениях.
«Метод GUIDE-seq очень прост в использовании, и мы намерены в ближайшем будущем сделать программное обеспечение для анализа данных секвенирования доступным онлайн для некоммерческих исследователей по адресу www.jounglab.org/guideseq», — добавляет Джунг, доцент патологии Гарвардской медицинской школы. Подана патентная заявка на технологию GUIDE-seq.