Теперь исследователи из Массачусетского технологического института и Медицинского института Говарда Хьюза (HHMI) определили скрытый, эфемерный феномен в клетках, который может играть важную роль в запуске производства мРНК и регуляции транскрипции генов.В статье, опубликованной в онлайн-журнале eLife, исследователи сообщают об использовании разработанной ими новой техники визуализации со сверхвысоким разрешением, чтобы увидеть отдельные молекулы мРНК, выходящие из гена в живой клетке. Используя тот же метод, они наблюдали, что незадолго до появления мРНК фермент РНК-полимераза II (Pol II) собирается в кластеры на одном и том же гене всего за несколько коротких секунд, прежде чем рассыпаться.Когда исследователи манипулировали кластерами ферментов таким образом, чтобы они оставались вместе в течение более длительных периодов времени, они обнаружили, что ген производил соответственно больше молекул мРНК.
Таким образом, кластеры Pol II могут играть центральную роль в запуске продукции мРНК и контроле транскрипции генов.Ибрагим Сиссе, доцент кафедры физики Массачусетского технологического института, объясняет, что из-за своей преходящей природы кластеры ферментов в значительной степени считались загадкой, и ученые сомневались, является ли такая кластеризация целенаправленной или просто случайной.
Эти новые результаты, по его словам, предполагают, что кластеризация ферментов, хотя и недолговечна, может оказывать значительное влияние на основные биологические процессы.«Мы думаем, что эти слабые и временные кластеры — фундаментальный способ для клетки контролировать экспрессию генов», — говорит Сиссе, старший автор статьи. «Если небольшая мутация хоть сколько-нибудь изменит время жизни кластера, это также может существенно изменить экспрессию гена. Кажется, это очень чувствительная ручка, которую клетка может настраивать».Более того, по словам Сиссе, ученые теперь могут исследовать кластеры Pol II как мишени, чтобы «остановить или вызвать всплеск транскрипции» и контролировать экспрессию определенных генов, исследовать лекарства от рака и другие методы генной терапии.
Соавторы статьи: Вон-Ки Чо, ведущий автор и постдок факультета физики; Намрата Джаянтх и Ян-Хенрик Спилле, также постдоки по физике; Такума Иноуэ и Дж. Оуэн Эндрюс, аспиранты по физике; и Уильям Конвей, студент факультета физики и биологии; а также исследователи из исследовательского кампуса Janelia HHMI: Брайан Инглиш, Джонатан Гримм, Люк Лавис и Тимоти Лионнет, который также является соавтором Cisse.
Изображение в сверхвысоком разрешенииФерменты Pol II группируются вместе только в течение очень коротких периодов времени, порядка нескольких секунд.
Эти кластеры также чрезвычайно малы, в масштабе 100 нанометров в ширину. Поскольку они такие крошечные и мимолетные, кластеры Pol II и другие слабые и временные взаимодействия в значительной степени скрыты от глаз, по существу, невидимые для обычных методов визуализации.Чтобы увидеть эти взаимодействия, Сиссе и его коллеги разработали метод визуализации сверхвысокого разрешения для визуализации клеточных процессов на уровне отдельных молекул.
Методика команды основана на двух существующих методах сверхвысокого разрешения — фотоактивационной микроскопии локализации (PALM) и микроскопии стохастической оптической реконструкции (STORM). Оба метода включают маркировку интересующих молекул и их подсветку одну за другой, чтобы определить, где каждая молекула находится в пространстве. Затем ученые могут объединить позиции каждой молекулы, чтобы создать одно изображение клеточного региона в сверхвысоком разрешении.Будучи невероятно точными, эти методы визуализации основаны на предположении, что каждая молекула остается неподвижной.
Молекулы, которые приходят и уходят, быстро группируются и рассеиваются, трудно отследить. Чтобы поймать кластеры Pol II в действии, Сиссе и его команда изменили существующие методы визуализации сверхвысокого разрешения, глядя не только на положение отдельного фермента, но и на частоту обнаружения молекул. Чем выше частота обнаружения, тем выше вероятность образования кластера.
Команда применила свою технику к ячейкам изображения, используя камеру, которая записывала один кадр каждые 50 миллисекунд, непрерывно работая до 10 000 кадров.Временное время жизниЗатем они создали клеточную линию, которая включала яркую флуоресцентную метку для мРНК, а также флуоресцентную метку другого цвета для ферментов Pol II.
Команда применила свою технику сверхвысокого разрешения для изображения определенного гена внутри клетки, называемого бета-актином, который был подробно охарактеризован. В экспериментах с живыми клетками исследователи заметили, что, хотя ранее транскрибированные молекулы мРНК загорались на гене, новые кластеры Pol II появлялись на том же гене в течение примерно 8 секунд, а затем разбирались.Из этих экспериментов группа была неуверена в том, оказывают ли кластеры какое-либо влияние на продукцию мРНК, поскольку время, необходимое от начала транскрипции до полного производства мРНК, занимает значительно больше времени — около 2,5 минут. Может ли кластер, появляющийся лишь на долю этого времени, оказывать какое-либо влияние на мРНК?
Чтобы ответить на этот вопрос, команда стимулировала клетки химическим коктейлем, который, как они знали, повлияет на транскрипцию генов и выход мРНК. В этих клетках они обнаружили, что непосредственно перед появлением пика мРНК на гене формировались кластеры, которые фактически оставались стабильными в течение 24 секунд — четырехкратное увеличение типичного времени жизни кластера. Более того, количество мРНК увеличилось на аналогичную величину.После повторения эксперимента на 207 живых клетках команда обнаружила, что время жизни кластеров Pol II напрямую связано с количеством мРНК, продуцируемой одним и тем же геном.
Сиссе предполагает, что, возможно, кластеры Pol II действуют как эффективный драйвер транскрипции генов, ускоряя в противном случае неэффективный процесс.«Логично, что вам не нужен эффективный процесс инициации, потому что вы не хотите случайным образом включать какой-либо ген только потому, что произошла случайная коллизия», — говорит Сиссе. «Но вы также хотите иметь способ изменить инициирование с неэффективного на эффективный процесс, например, когда вы хотите экспрессировать ген в ответ на некоторые стимулы окружающей среды. Мы думаем, что эти временные кластеры, вероятно, являются способом, которым клетка может сделать инициацию транскрипции эффективной ».Затем Сиссе планирует продолжить свои исследования кластеров Pol II, чтобы определить, какие силы удерживают их вместе, а также как они образуются и имеют ли другие молекулярные факторы кластеры с аналогичными эффектами.
«Я подозреваю, что есть новые биофизические явления, возникающие в результате слабых и временных взаимодействий», — говорит Сиссе. «Это малоизученная область биологии, и поскольку взаимодействия настолько неуловимы, мы очень мало понимаем, как регулирующие процессы происходят внутри живой клетки».