«Мы обнаружили, что экспрессия CRISPR-Cas RGN в клетках человека может иметь нецелевые эффекты, которые, как ни странно, могут происходить в сайтах со значительными отличиями последовательностей от целевого сайта ДНК», — говорит Дж. Кейт Джунг, доктор медицинских наук, заместитель руководителя для исследований в отделении патологии Массачусетской больницы общего профиля (MGH) и соавтор отчета, получающего онлайн-публикацию в журнале Nature Biotechnology. «RGN по-прежнему имеют огромные преимущества по сравнению с другими технологиями редактирования генома, но эти результаты теперь сосредоточили нашу работу на улучшении их точности».Состоящие из фермента, расщепляющего ДНК, называемого Cas 9, соединенного с коротким 20-нуклеотидным сегментом РНК, который соответствует целевому сегменту ДНК, CRISPR-Cas RGN имитирует примитивные иммунные системы некоторых бактерий. Когда эти микробы заражаются вирусами или другими организмами, они копируют сегмент генетического кода захватчика и встраивают его в свою ДНК, передавая его будущим поколениям бактерий.
Если тот же патоген встретится в будущем, бактериальный фермент Cas9, руководствуясь последовательностью РНК, соответствующей скопированному сегменту ДНК, инактивирует патоген, разрезая его ДНК на целевом участке.Около года назад ученые сообщили о первом использовании запрограммированных CRISPR-Cas RGN для нацеливания и разрезания определенных участков ДНК. С тех пор несколько исследовательских групп, включая Joung’s, успешно использовали CRISPR-Cas RGN для внесения геномных изменений в плодовых мушках, рыбках данио, мышей и в клетках человека, включая индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, которые обладают многими характеристиками эмбриональных стволовых клеток.
Зависимость технологии от такого короткого сегмента РНК делает CRISPR-Cas RGN намного проще в использовании, чем другие инструменты редактирования генов, называемые нуклеазами цинковых пальцев (ZFN) и эффекторными нуклеазами, подобными активаторам транскрипции (TALEN), и RGN могут быть запрограммированы на введение нескольких генетические изменения одновременно.Однако возможность того, что CRISPR-Cas RGN могут вызывать дополнительные, нежелательные генетические изменения, в значительной степени не исследована, поэтому команда Йонга приступила к исследованию возникновения мутаций «нецелевых» в человеческих клетках, экспрессирующих CRISPR-Cas RGN. Поскольку взаимодействие между направляющим сегментом РНК и целевой ДНК зависит только от 20 нуклеотидов, они предположили, что РНК может также распознавать сегменты ДНК, которые отличаются от мишени на несколько нуклеотидов.Хотя предыдущие исследования показали, что несоответствие одного нуклеотида может предотвратить действие некоторых CRISPR-Cas RGN, эксперименты группы MGH на линиях клеток человека обнаружили несколько случаев, в которых несовпадение целых пяти нуклеотидов не предотвращало расщепление отщепляемого остатка. целевой сегмент ДНК.
Они также обнаружили, что частота мутаций на нецелевых сайтах может быть столь же высокой или даже выше, чем на целевых сайтах, чего не наблюдалось с мутациями нецелевых, связанных с ZFN или TALEN.«Наши результаты не означают, что RGN не могут быть важными инструментами исследования, но они означают, что исследователи должны учитывать эти потенциально мешающие эффекты в своих экспериментах.
Они также предполагают, что существующая платформа RGN может быть не готова для терапевтических приложений», — сказал он. — говорит Джунг, доцент кафедры патологии Гарвардской медицинской школы. «Сейчас мы работаем над способами уменьшения этих нецелевых эффектов, а также над методами выявления всех потенциальных нецелевых сайтов любой данной RGN в клетках человека, чтобы мы могли оценить, будут ли какие-либо разработанные платформы RGN второго поколения на самом деле более точным в масштабе всего генома. Я оптимистично настроен, что мы сможем продолжить разработку этой системы для достижения большей специфичности, чтобы ее можно было использовать для терапии человеческих заболеваний ».