«Эта система сочетает в себе простоту использования широко распространенной системы CRISPR / Cas с зависимой от димеризации нуклеазной активностью, которая обеспечивает более высокую специфичность действия», — говорит Дж. Кейт Джунг, доктор медицинских наук, заместитель начальника отдела исследований в отделе MGH.
Патология и старший автор отчета. «Более высокая специфичность будет важна для любого будущего клинического использования этих нуклеаз, и новый класс белков, который мы описываем, может предоставить важную возможность для терапевтического редактирования генома».Сконструированные нуклеазы CRISPR-Cas — инструменты редактирования генома, которые объединяют короткий сегмент РНК, соответствующий его ДНК-мишени, с ферментом, расщепляющим ДНК под названием Cas9, — были предметом многочисленных исследований с момента их первоначальной разработки в 2012 году.
Более ранние системы ZFN (нуклеаза цинкового пальца) и TALEN (эффекторная нуклеаза, подобная активатору транскрипции) успешно индуцировали геномные изменения в нескольких модельных системах на животных и в клетках человека. Но в предыдущей статье Nature Biotechnology, опубликованной в июне 2013 года, команда Юнга сообщила, что нуклеазы CRISPR-Cas могут вызывать дополнительные мутации в клетках человека, даже в тех участках, которые отличаются от ДНК-мишени на целых пять нуклеотидов.Чтобы решить эту проблему, исследователи разработали новую платформу, в которой целевая функция Cas9 была слита с нуклеазой, полученной из хорошо изученного фермента под названием Fokl, который функционирует только тогда, когда две копии молекулы спарены, и эта связь называется димеризацией. Это изменение существенно удвоило длину ДНК, которая должна распознаваться для расщепления этими новыми нуклеазами Fokl (RFN), управляемыми РНК CRISPR, что значительно повысило точность редактирования генома в клетках человека.
Важно отметить, что Joung и его коллеги также продемонстрировали, что эти новые RFN столь же эффективны при модификации на мишени, как и существующие нуклеазы Cas9, которые нацелены на более короткую последовательность ДНК.«Удвоив длину распознаваемой последовательности ДНК, мы разработали новый класс инструментов для редактирования генома с существенно улучшенной точностью по сравнению с существующими нуклеазами Cas9 дикого типа и никазами (ферментами, которые расщепляют одну цепь ДНК)», — говорит Джунг. доцент кафедры патологии Гарвардской медицинской школы.
Исследовательская группа также разработала программное обеспечение, позволяющее пользователям определять потенциальные целевые сайты для этих RFN, и включила эту возможность в ZiFiT Targeter, программный пакет, свободно доступный на http://zifit.partners.org.