Теперь исследователи из исследовательского кампуса Janelia при Медицинском институте Говарда Хьюза разработали способ решения этой проблемы. Они разработали новый вычислительный метод, который может быстро отслеживать трехмерные движения клеток на таких богатых данными изображениях. Используя этот метод, ученые Джанелии могут автоматизировать большую часть трудоемкого процесса реконструкции плана развития животного, клетка за клеткой.
Филипп Келлер, руководитель группы в Janelia, возглавил команду, которая разработала вычислительную структуру. Он и его коллеги, включая постдока Джанелию Фернандо Амат, лидера группы Джанелии Кристин Брэнсон и бывшего руководителя лаборатории Джанелии Юджина Майерса, который сейчас работает в Институте молекулярной клеточной биологии и генетики Макса Планка, использовали этот метод для реконструкции клеточного происхождения во время развития ранняя нервная система у плодовой мушки. Их метод можно использовать для отслеживания клеточных клонов у множества организмов и эффективно обрабатывать данные, полученные с разных типов флуоресцентных микроскопов.
Ученые описывают свой подход в статье, опубликованной 20 июля 2014 года в журнале Nature Methods.
В 2012 году Келлер разработал одновременный многовидовой (SiMView) световой микроскоп, который снимает трехмерные изображения с беспрецедентной скоростью и точностью в течение нескольких часов или дней. Изображения под микроскопом могут выявить деления и сложные перестройки отдельных клеток по мере появления биологических структур в развивающемся эмбрионе.
С тех пор Келлер совершенствовал систему, чтобы с ее помощью можно было следить за развитием ранней нервной системы организма.
«Мы хотим реконструировать элементарный план построения животных, отслеживая каждую клетку от очень раннего развития до поздних стадий, чтобы мы знали все, что произошло с точки зрения движения и деления клеток», — говорит Келлер. «В частности, мы хотим понять, как формируется нервная система. В конечном итоге мы хотели бы собрать историю развития каждой клетки нервной системы и связать эту информацию с конечной функцией клетки. Для этого нам нужно иметь возможность отслеживать отдельные ячейки в достаточно большом масштабе и в течение длительного периода времени."
Для того, чтобы нервная система у эмбриональной мыши стала функционировать, требуется более недели. Даже у плодовой мухи процесс занимает день.
Дальнейшая разработка означает визуализацию десятков тысяч ячеек в тысячи временных точек, а это в сумме дает терабайты данных. «Мы можем получить хорошие наборы данных изображений, но если вы хотите их реконструировать, это то, что человек действительно не может сделать без помощи компьютера», — говорит Келлер.
Амат, специалист по биоинформатике из команды Келлера, и его коллеги решили эту проблему с помощью нового вычислительного метода, который идентифицирует и отслеживает делящиеся клетки так же быстро, как их высокоскоростной микроскоп может захватывать изображения. Процесс в значительной степени автоматизирован, но включает в себя этап ручного редактирования для повышения точности для небольшого процента ячеек, которые трудно отслеживать с помощью вычислений.
Команда Келлера пыталась понять, как интерпретировать такие данные изображений с 2010 года. Проблема была сложной не только из-за огромного объема данных, полученных с его светового микроскопа, но и из-за сложности данных.
Клетки в развивающемся эмбрионе имеют разную форму и поведение и могут быть плотно упакованы, что затрудняет идентификацию и отслеживание отдельных клеток компьютеру. Неизбежные колебания качества изображения еще больше усложняют анализ.
Амат руководил разработкой эффективного решения. Его первоочередной задачей было уменьшить сложность данных.
Его стратегия заключалась в том, чтобы сначала сгруппировать воксели (по сути, трехмерные пиксели), составляющие каждое изображение, в более крупные единицы, называемые супервокселями. По словам Келлера, использование супервокселя в качестве наименьшего элемента снижает сложность изображения в тысячу раз.
Затем программа ищет формы эллипсоидов среди групп связанных супервокселей, которые распознает как ядра клеток.
После того, как кластер супервокселей был идентифицирован как ядро клетки, компьютер использует эту информацию, чтобы снова найти ядро на последующих изображениях. С помощью высокоскоростной микроскопии изображения получаются достаточно быстро, поэтому отдельная клетка не может перемещаться очень далеко от кадра к кадру. «Мы пользуемся этой ситуацией и используем решение из одной временной точки в качестве отправной точки для следующей точки», — говорит Келлер.
«Благодаря этому довольно быстрому и простому подходу мы можем довольно эффективно решать простые дела», — говорит Келлер.
Эти случаи составляют около 95 процентов данных. «В более сложных случаях, когда у нас могут быть ошибки, мы используем более тяжелую технику."
Он объясняет, что в случаях, когда ячейки труднее отслеживать — например, из-за плохого качества изображения или переполненности ячеек — компьютер использует дополнительную информацию. «Мы смотрим на то, что делают все клетки в этом районе, немного в будущее и немного в прошлое», — объясняет Келлер. Информативные шаблоны обычно возникают из этой контекстной информации. Стратегия требует больше вычислительных мощностей, чем первоначальная тактика. «Мы не хотим делать это для всех ячеек», — говорит Келлер. "Но мы пытаемся раскрыть эти сложные случаи, собирая больше информации и принимая более обоснованные решения."
Все эти шаги могут быть выполнены так же быстро, как изображения, полученные с помощью микроскопа, и в результате будет получена информация о происхождении каждой клетки. "Вы знаете путь, вы знаете, где он находится в определенный момент времени. Вы знаете, что он разделился в определенный момент, вы знаете дочерние клетки, вы знаете, из какой материнской клетки он произошел », — говорит Келлер.
Наконец, вмешивается человек, чтобы проверить работу компьютера и исправить ошибки. Сгенерированная компьютером «оценка достоверности» для каждой ячейки в каждый момент времени направляет пользователя к небольшому проценту данных, которые, скорее всего, потребуют человеческого глаза, что обеспечивает высокую общую точность без ручного исследования каждой ячейки.
Чтобы проверить возможности программы, команда Келлера собрала изображения зародыша нервной системы, когда она развивалась у эмбриона плодовой мушки. Они использовали свой метод для отслеживания клонов 295 нейробластов (предшественников нервных клеток) и обнаружили, что можно предсказать будущую судьбу и функцию многих клеток на основе их раннего динамического поведения.
Келлер хочет начать использовать этот метод для исследования множества вопросов о раннем развитии и надеется, что другие применит этот подход к своим собственным вопросам. С этой целью команда позаботилась о том, чтобы эту технику можно было использовать с различными типами данных.
Помимо плодовых мушек, они успешно использовали программу для анализа изображений рыбок данио и мышей, а также данных, собранных с помощью коммерческого светового микроскопа и коммерческого конфокального микроскопа.
Их программное обеспечение с открытым исходным кодом можно бесплатно скачать по адресу http: // www.Джанелия.org / lab / keller-lab /.
Избранные видео (Видео предоставлено лабораторией Филиппа Келлера, Исследовательский кампус HHMI Janelia)
Видео 2: https: // www.Dropbox.com / s / vmr54us4osjfyw5 / Supplementary_Video_2% 20ProResHQ.mov
Автоматическая сегментация и отслеживание в наборе данных SiMView об эмбриогенезе дрозофилы (градиентный цветовой код)
В этом видео показана автоматическая вычислительная реконструкция клеточного происхождения данных изображения.
Каждый кружок представляет собой одно ядро клетки. Хвосты кружков (сплошные линии) обозначают историю положения объектов за последние 10 временных точек. Цветовая схема была инициализирована в первом кадре с использованием цветового градиента от переднего к заднему, с использованием разных цветов на дорсальной и вентральной сторонах и обеспечения непрерывности цветового пространства на переднем и заднем концах эмбриона.
После этого начального назначения цвета информация о цвете распространялась во времени с использованием информации отслеживания, обеспечивая, таким образом, карту судьбы разрешения одной клетки с цветовой кодировкой. Некоторые детекции ядра клетки соответствуют фоновым объектам, возникающим из-за автофлуоресценции и ограничений в качестве изображения.
Видео 20: https: // www.Dropbox.ru / s / zueg4fff1amwilj / Supplementary_Video_20% 20ProRes422HQv.2.mov
Автоматическая сегментация и отслеживание в наборе данных SiMView об эмбриогенезе рыбок данио (градиентный цветовой код)
В этом видео показана автоматическая вычислительная реконструкция клеточного происхождения данных изображения. Каждый кружок представляет собой одно ядро клетки. Хвосты кружков (сплошные линии) обозначают историю положения объектов за последние 10 временных точек.
Цветовая схема была инициализирована в первом кадре с использованием радиально-симметричного цветового градиента от животного полюса к периферии бластодермы. После этого начального назначения цвета информация о цвете распространялась во времени с использованием информации отслеживания, обеспечивая, таким образом, карту судьбы разрешения одной клетки с цветовой кодировкой. Некоторые детекции ядра клетки соответствуют фоновым объектам, возникающим из-за автофлуоресценции и ограничений в качестве изображения.
Видео 25: https: // www.Dropbox.com / s / 46qjosezn9r3stz / Supplementary_Video_25ProResHQ422.mov
Движения и деления нервных предшественников в нервной системе раннего эмбриона дрозофилы (по данным SiMView)
На этом видео показаны вентральные и боковые проекции максимальной интенсивности с помощью покадровой записи SiMView зародыша дрозофилы, меченых ядрами, наложенных зелеными сферами, отмечающими расположение, движения и деления нервных предшественников на стадии бластодермы в течение 5 часов после откладки яиц. Хвосты указывают историю положений ячеек за последние десять временных точек с использованием цветового кода, который постепенно переходит от фиолетового к белому в зависимости от времени.
Видео 28: https: // www.Dropbox.com / s / q21xrxo624txgd4 / Supplementary_Video_28-ProResHQ422.mov
Реконструкция клеточного клона раннего развития эмбриональной нервной системы дрозофилы
Это видео вращающегося изображения треков нервных клеток-предшественников, полученных в результате реконструкции клеточного клона раннего эмбрионального развития нервной системы дрозофилы.
Дорожки представлены сплошными линиями с использованием цветового кода, который указывает время (от пурпурного до белого: от стадии бластодермы до конечной точки реконструкции через 5 часов после откладки яиц). Расположение ячеек в конечной точке реконструкции отмечено зелеными сферами.
Передняя слева, задняя справа.