В новом исследовании исследователи из Института биодизайна Университета штата Аризона использовали инновационный метод для скрининга широкого спектра киназ на предмет эффективности лекарства. Соединение, известное как ибрутиниб — ингибитор тирозоинкиназы (BTK) Брутона в лейкоцитах, было впервые одобрено FDA в 2013 году для лечения лейкемии.
Используя сложную платформу микрочипов, изобретенную доктором.
Джошуа ЛаБаер, новое исследование демонстрирует, что ибрутиниб также может воздействовать на малоизученного члена семейства RTK, известного как ERBB4, потенциально препятствуя последовательности событий, ведущих к прогрессированию и росту других солидных опухолей. ЛаБаер — директор Института биодизайна и Университета штата Вирджиния.
Центр персонализированной диагностики Piper.
Результаты показывают, что ибрутиниб действует как мощный ингибитор киназы ERBB4, ограничивает рост раковых клеток человека в лаборатории и уменьшает размер опухоли у мышей. Чувствительность ERBB4 к ибрутинибу аналогична чувствительности BTK, исходной мишени препарата.
В исследовании представлен новый метод скрининга для поиска новых мишеней для лекарств, таких как ингибиторы киназ, и продемонстрирована потенциальная терапевтическая полезность существующего фармацевтического препарата для избирательного нацеливания на ERBB4 в дополнение к его первоначальной мишени BTK. (Нарушение регуляции BTK связано с неконтролируемой пролиферацией В-клеток, что приводит к лейкемии, лимфоме и другим заболеваниям.)
«Мы особенно взволнованы, потому что это демонстрирует, что белки в этих массивах функционально активны таким образом, который отражает их естественную активность и позволяет нам проверять их реакцию на селективные лекарства», — сказал ЛаБаер. "Теперь это предоставляет инструмент, который позволит нам искать нецелевых респондентов на лекарства или определять, как конкретные приобретенные мутации могут повлиять на реакцию на лекарства."
Результаты исследования опубликованы в расширенном онлайн-издании журнала Oncogen.
Новый вид проверки на наркотики
Чтобы изучить тонкое поведение ERBB4, исследователи используют технологию, известную как микроматрица белков, которая представляет собой микроскопическую поверхность, отображающую множество различных белков, каждый в отдельных точках.
Таким образом, можно одновременно исследовать большое количество белков. Используя этот метод, исследователи изучают взаимодействие белков с другими белками, их связывающую активность с нуклеиновыми кислотами, такими как ДНК и РНК, или с факторами, обнаруженными в крови, включая широкий спектр патогенов.
Обычно печать белков на слайдах была неэффективным и трудоемким процессом, потому что белки представляют собой тонкие трехмерные структуры, которые должны складываться правильным образом, чтобы быть функциональными. Однако белки на обычных белковых массивах обычно производятся в нечеловеческих системах, и требуются сложные этапы очистки белков, которые затрудняют поддержание стабильности белков с течением времени.
В текущем исследовании применяется революционная технология, известная как NAPPA (для массива белков, программируемых нуклеиновыми кислотами).
Вместо того, чтобы печатать очищенные белки на предметном стекле микроматрицы, NAPPA сначала печатает кольцевую ДНК, известную как плазмиды, которые содержат генетические коды для представляющих интерес белков, а затем синтезирует целевые белки точно в срок на месте, добавляя экстракт клеток человека для более естественного белка. складывание. Таким образом, массив NAPPA может обеспечить высокофункциональную и эффективную систему для экспрессии и скрининга белков.
"Вы можете экспрессировать функциональный белок в течение полутора часов.
Это круто, — говорит доктор. Фемина Рауф, ведущий автор нового исследования. «Мы используем лизатную систему человека для экспрессии белков, поэтому мы ожидаем увидеть хорошо свернутые функциональные белки. Мы особенно взволнованы, потому что RTK — это мембранные белки, которые обычно сложно экспрессировать, но все еще активны здесь."
Клеточные пути рака
На разработку противораковых препаратов, таких как ингибиторы киназы, требуются десятилетия, что требует огромных финансовых затрат, что делает перспективу перепрофилирования существующих лекарств (путем поиска новых представляющих интерес целей) особенно привлекательной.
Мутации в RTK считаются движущей силой развития рака.
Группа из четырех важных рецепторов, EGFR, ERBB2, ERBB3 и ERBB4, известных как семейство рецепторных тирозинкиназ ErbB, активируется сигнальными молекулами, известными как факторы роста эпителия. Эти специализированные молекулы играют решающую роль в развитии и созревании клетки.
Пациенты, опухоли которых содержат мутации рецептора ERBB, часто демонстрируют более агрессивное прогрессирование рака и имеют худшие клинические исходы. По этой причине рецепторы тирозинкиназы вызывают большой интерес в медицинском сообществе как кандидаты на лекарственные препараты, нацеленные на различные типы рака.
Хотя EGFR и ERBB2 уже используются в качестве важных терапевтических мишеней и (наряду с ERBB3) подверглись тщательному изучению, мало что известно о четвертом члене семейства RTK: ERBB4. Этот рецептор вызывает растущий интерес, поскольку в недавних исследованиях мутации в ERBB4 были связаны с меланомой и раком легких, а измененная экспрессия ERBB4 наблюдалась при раке груди, нейробластоме, раке толстой кишки и немелкоклеточном раке легких.
Кроме того, ERBB4 может играть роль в других заболеваниях, включая боковой амиотрофический склероз, а также нарушениях развития нервной системы, таких как аутизм и шизофрения.
«Никто не проводил систематических исследований препаратов для ERBB4. Исследователи, как правило, сосредотачиваются на EGFR и ERBB2, потому что они являются привлекательными целями в области рака », — говорит Рауф. «В недавних отчетах было обнаружено множество мутаций в ERBB4, особенно при раке легких и меланоме, что позволяет предположить, что этот рецептор может играть важную роль в онкогенезе или развитии рака», — говорит она.
ERBB4, как и другие члены семейства киназных рецепторов, представляет собой мембранный белок, рецепторный компонент которого выступает из поверхности клетки, чтобы улавливать сигнальные молекулы во внеклеточной среде, в то время как внутриклеточная часть ERBB4 содержит сегмент, называемый киназным доменом, а также остатки тирозина, аминокислоты.
Когда сигнальные молекулы связываются с внеклеточным рецептором ERBB4, его киназный домен внутри клетки добавляет фосфаты к остаткам тирозина, запуская цепную реакцию сигнальных событий. Этот процесс известен как фосфорилирование белка и играет решающую роль во множестве клеточных событий, включая прогрессирование и пролиферацию рака, и это исследование показало, что ибрутиниб может блокировать этот процесс, подавляя киназную функцию ERBB4.
Подсказки о раке
В ходе исследования было иммобилизовано 108 различных протеинкиназ и 30 нон-киназ на слайде NAPPA, включая ERBB4 и другие RTK. Когда матрица подвергалась воздействию ибрутиниба, препарат тесно связывался с двумя специфическими белками. Первый — это БТК, связывающий белок, для которого лекарство было первоначально разработано.
Удивительно, но ибрутиниб также связывал ERBB4 с аналогичным сродством.
Пара тестов in vitro использовалась для подтверждения активности ибрутиниба на ERBB4. Результаты исследования впервые демонстрируют силу NAPPA как беспристрастной платформы для скрининга наркотиков.
Установив ибрутиниб в качестве лекарственного средства-кандидата для нацеливания на ERBB4, следующим шагом было его тестирование в реальных биологических условиях, сначала на клеточных линиях, сверхэкспрессирующих ERBB4, и, наконец, на мышах.
В ряде клеточных линий ибрутиниб блокировал пролиферацию.
Однако другие клетки проявили устойчивость к препарату. Выполнив секвенирование РНК, группа выяснила паттерны экспрессии генов, связанные с устойчивостью.
Результаты показали, что клетки, экспрессирующие высокие уровни WNT5A, активатора пути Wnt, и низкие уровни DKK1, ингибитора пути Wnt, были устойчивы к препарату, ингибирующему киназу. Напротив, низкие уровни экспрессии WNT5A и DKK1 были связаны с чувствительностью клеток к ибрутинибу и снижением роста клеток при воздействии препарата.
Эти результаты согласуются с недавними крупномасштабными исследованиями, которые дают заманчивые подсказки о том, что одна из функций известного онкогена WNT5A — придавать устойчивость к определенным лекарствам.
Когда ибрутиниб-чувствительные клетки, экспрессирующие высокие уровни ERBB4, были перенесены на мышей, было показано, что ибрутиниб уменьшает размер опухолей, демонстрируя сильный потенциал препарата в лечении рака, связанного с ERBB4.
Полученные данные особенно ценны, поскольку в настоящее время проводится ряд клинических испытаний с использованием ибрутиниба для лечения солидных опухолей. Сверхэкспрессия ERBB4 была отмечена при ряде заболеваний, включая рак молочной железы и рак яичников.
Обнаружение сигнатуры устойчивости к ибрутинибу поможет клиницистам интерпретировать результаты своего лечения и оценить, когда ибрутиниб с наибольшей вероятностью будет успешным. Использование ибрутиниба, возможно, в сочетании с другими лекарствами, направленными на пути клеточной резистентности, может проложить путь для нового арсенала методов лечения рака.