Нагоя, Япония. Флуоресцентная микроскопия со сверхвысоким разрешением, которая была отмечена Нобелевской премией по химии 2014 года, позволяет нам визуализировать биологические системы и получить подробное представление о сложной динамике биомолекул. В частности, микроскопия стимулированного истощения излучения (STED) широко используется для изучения различных процессов в живых системах из-за ее высокой скорости сбора данных и совместимости с различными биологическими образцами.
Химики из Института трансформирующих биомолекул (ITbM) Университета Нагоя разработали новый фотостабильный флуоресцентный краситель PhoxBright 430 (PB430), который обеспечивает непрерывную визуализацию STED флуоресцентно меченых клеток со сверхвысоким разрешением. Поскольку PB430 содержит функциональную группу, обеспечивающую конъюгацию с антителом, конкретные биомолекулы-мишени внутри клетки могут быть окрашены иммунофлуоресценцией.
Исключительная фотостабильность PB430 оказалась полезной для построения 3D-STED-изображения микротрубочек (трубчатых белковых структур, которые образуют цитоскелет, который является внутренним каркасом клетки) и достижения многоцветной STED-визуализации флуоресцентно иммуномеченных цитоскелетов с помощью комбинация фотостабильного PB430 и имеющихся в продаже красителей.Уникальные свойства PB430 делают его мощным инструментом для выявления структур и функций клеток, и он может применяться для длительной визуализации движения органелл и молекул внутри клеток. Результаты этого исследования недавно опубликованы в Журнале Американского химического общества.Для достижения высокого разрешения в микроскопии STED биологический образец, помеченный флуорофором (флуоресцентный краситель, используемый для маркировки биологических образцов, таких как белки, ткани и клетки), облучают пучком возбуждения флуоресценции вместе с пучком STED в форме пончика для подавляют возбуждение окружающих молекул.
Несмотря на то, что это мощный метод, потребность в пучке STED высокой интенсивности, который приводит к фотообесцвечиванию красителей, является серьезной проблемой для практического использования STED-микроскопии в непрерывной визуализации живых клеток.Исследователи ранее сообщали о флуоресцентном красителе C-Naphox, который продемонстрировал сильную фотостабильность при визуализации STED.
Теперь группа оптимизировала структуру C-Naphox и разработала новый фотостабильный флуоресцентный краситель PB430, который можно использовать для визуализации структур внутри клеток.«C-Naphox продемонстрировал, что является чрезвычайно фотостабильным красителем для STED-визуализации различных материалов, поэтому мы решили дополнительно настроить его свойства, чтобы мы могли применять его для визуализации ультраструктур», — говорит Масаясу Таки, доцент ITbM и один из лидеры этого исследования. «Наш новый краситель PB430 демонстрирует повышенную растворимость в воде, эффективно флуоресцирует в водной среде и способен маркировать антитела. Нам было приятно наблюдать, что он также демонстрирует высокую фотостабильность в условиях STED», — описывает Таки.
Ченгуан Ван, научный сотрудник исследовательской группы профессора Шигехиро Ямагути в ITbM, синтезировал PB430 и провел эксперименты по визуализации STED. Подобно C-Naphox, новый флуоресцентный краситель стабилен на воздухе и состоит из структурно усиленного скелета, соединенного с кольцом? -Конъюгированного скелета, который содержит фосфол-P-оксидный элемент, который является источником названия PhoxBright. Вместо трифениламинового фрагмента PB430 имеет группу карбоновой кислоты, которая может конъюгироваться с антителами для иммуномечения посредством образования N-гидроксилсукцинимидилового (NHS) сложного эфира.Эксперименты STED по визуализации конъюгированных с PB430 антител в фиксированных клетках HeLa привели к флуоресцентным изображениям иммуномеченых микротрубочек с незначительным фотообесцвечиванием.
PB430 действовал как флуоресцентная метка для белков, и его интенсивность флуоресценции сохранялась даже при конъюгировании.«Высокая фотостабильность PB430 позволяет получать изображения флуоресценции, что было нелегко сделать с помощью обычных красителей», — объясняет Таки. «Например, PB430 можно использовать в 3D-визуализации цитоскелета в STED, потому что он может выдерживать непрерывный STED-луч по оси z после визуализации по оси xy».Кроме того, группа показала, что PB430 можно применять для многоцветной STED-визуализации, используя разницу в фотостабильности между различными флуоресцентными красителями.
Они выполнили эксперименты по визуализации STED микротрубочек и виментина (белков промежуточных филаментов) цитоскелета, иммуномеченных PB430 и Alexa Fluor 430 (флуоресцентный краситель), соответственно. Поскольку Alexa Fluor 430 фотообесцвечивается после получения первого изображения STED, на втором изображении видны только микротрубочки, меченные PB430.
Вычитание первого изображения из второго показывает меченые Alexa Fluor 430 филаменты виментина.«Обычно для получения многоцветных STED-изображений требуется несколько лазеров возбуждения и один лазерный луч STED, но в сочетании Alexa Fluor 430 с PB430 нам нужна только одна пара лазеров возбуждения и STED», — объясняет Таки. «Используя PB430, мы полагаем, что можно будет проводить многоцветную STED-визуализацию с использованием ряда различных комбинаций различных флуоресцентных красителей. Следующим шагом является улучшение проницаемости красителя через клеточную мембрану, чтобы визуализировать функции многих других клеточные структуры, — продолжает он.
«Наше исследование показало, что сильная фотостабильность и физиологическая совместимость PB430 позволяет проводить повторную визуализацию, а также трехмерную визуализацию и многоцветную визуализацию клеток с помощью микроскопии STED», — говорит Ямагути. «Мы надеемся, что сможем применить наш флуоресцентный краситель для длительной визуализации живых клеток с помощью микроскопии STED и микроскопии одиночных молекул, чтобы исследовать различные биологические процессы».