Этот подход, разновидность адаптивной оптики, работает в тканях, которые не рассеивают свет, что делает его хорошо подходящим для визуализации прозрачных тел рыбок данио и круглых червей Caenorhabditis elegans, важных модельных организмов в биологических исследованиях. Руководитель группы Janelia Эрик Бетциг говорит, что его команда разработала новую технологию, объединив стратегии адаптивной оптики, которые астрономы и офтальмологи используют для устранения подобных искажений на своих изображениях.В отчете, опубликованном в Интернете 13 апреля 2014 года в журнале Nature Methods, Бетциг, научный сотрудник Кай Ван и их коллеги показывают, как этот метод фокусирует внимание на тонких, разветвленных структурах и субклеточных органеллах нервных клеток глубоко в живом мозге. данио.
Эти структуры остаются размытыми и нечеткими под тем же микроскопом без адаптивной оптики. «Результаты впечатляют», — говорит Бетциг. «Это действительно переводит применение адаптивной оптики в микроскопию на совершенно другой уровень».«Наша методика действительно надежна, и вам не нужно ничего особенного для ее применения. [В будущем] она может стать очень удобным дополнительным компонентом к коммерчески доступным микроскопам», — говорит Ван, научный сотрудник лаборатории Бетцига. .За последнее десятилетие Бетциг и другие по примеру астрономов использовали адаптивную оптику для коррекции неоднородности биологических тканей, изгибающей свет.
Бетциг объясняет, что астрономы применяют адаптивную оптику, направляя лазер высоко в атмосферу в том же направлении, что и объект, который они хотят наблюдать. Свет, возвращающийся от этой так называемой звезды-проводника, искажается, когда проходит через турбулентную атмосферу обратно к телескопу. Используя инструмент, называемый датчиком волнового фронта, астрономы непосредственно измеряют это искажение, а затем используют измерения для деформации зеркала телескопа, чтобы нейтрализовать атмосферные аберрации. Коррекция дает более четкое представление о целевом объекте, за которым они хотят наблюдать.
Техника микроскопии, которую Бетциг разработала в 2010 году вместе с На Джи, которая сейчас также является руководителем группы в Janelia, дает аналогичные результаты за счет использования изолированного флуоресцентного объекта, такого как тело клетки или внедренный шарик в ткань, в качестве «путеводной звезды». Эта цель отображается много раз под разными углами, чтобы определить, какую коррекцию следует применить.
Хотя этот подход работает даже в рассеивающих тканях, таких как мозг мыши, где новый метод не работает, процесс медленный и подвергает образец воздействию большого количества потенциально опасного света. Чтобы улучшить изображения больших образцов, где аберрация быстро меняется с положением, исследователям нужно было ускорить процесс коррекции.
Бетциг и Ван сосредоточились на разработке стратегии адаптивной оптики для новых методов микроскопии, которые позволяют неинвазивно получать изображения динамических процессов с высоким разрешением. Такие технологии, такие как микроскоп с плоскостным освещением Бесселя, который команда Бетцига разработала в 2011 году, и одновременный многовидовой световой микроскоп, разработанный руководителем лаборатории Janelia Филиппом Келлером в 2012 году, хорошо работают с клетками или маленькими эмбрионами, но качество изображения ухудшается в больших образцы.
Эти микроскопы используются исключительно для получения изображений прозрачных образцов, что сужает объем проблемы. Бетцигу и Вангу требовался быстрый неинвазивный способ коррекции неоднородностей в составе клеток и тканей, но, поскольку он будет использоваться только на прозрачной ткани, им не нужно было компенсировать светорассеяние.«Если вы находитесь в режиме, в котором отсутствует рассеяние, то вы можете делать именно то, что делают астрономы», — говорит Бетциг, поясняя, что, поскольку прозрачная ткань не скремблирует световые волны, возвращаемые опорной звездой, они могут обнаруживать и измерять его волновой фронт напрямую.Команда создала путеводную звезду, сфокусировав свет микроскопа в светящейся точке в образце.
Используя технику, называемую двухфотонным возбуждением, они могли проникать инфракрасный свет глубоко внутрь ткани и освещать определенную точку. Затем датчик волнового фронта определил бы, как свет, возвращающийся от этой звезды-проводника, искривлялся, проходя через ткань, чтобы можно было применить соответствующую коррекцию.Однако из-за того, что биологическая ткань настолько неоднородна, ситуация была более сложной. «В биологии, в отличие от астрономии, ошибки волнового фронта действительно сложны», — говорит Бетциг. «По мере того, как свет от направляющей звезды возвращается к датчику, волновой фронт в микроскопии становится намного более неровным, чем в астрономии. Если вы зафиксируете направляющую звезду в одной точке, эта неровность сбивает датчик с толку, поэтому вы не получите хорошей коррекции. " Кроме того, коррекция, которая работает в одной точке, не будет эффективной в другой точке образца, которая по-другому изгибает световые волны.
Решение этой проблемы, как определили Бетциг и Ван, состоит в том, чтобы сканировать направляющую звезду по небольшой области образца, а не оставлять ее на одном месте.
Чтобы датчик мог интерпретировать информацию, возвращаемую этой движущейся направляющей звездой, свет должен быть неподвижным или «рассканированным». Это достигается за счет отражения света от одних и тех же зеркал, которые наклоняются, чтобы проецировать направляющую звезду на разные точки образца. Результирующий волновой фронт используется для генерации средней коррекции по сканируемой области.Бетциг объясняет, что аналогичная стратегия включена в адаптивную оптику, которая корректирует изображения сетчатки пациентов, которые искажаются, когда свет проходит через роговицу и хрусталик глаза.
Измерение и исправление этих аберраций затруднено движением глаз пациентов, поэтому при офтальмологической визуализации используется десканирование для усреднения ошибок, вызванных движением.«Мы объединили концепцию сканирования, разработанную офтальмологами, с лазерными направляющими звездами астрономов, и придумали действительно хорошее решение для аберрирующих, но не рассеивающих прозрачных образцов, таких как рыба данио», — говорит Бетциг.
«Мы продолжали продвигать эту технологию, и оказалось, что она работает», — говорит Ван. «Когда мы сравниваем качество изображения до и после исправления, оно сильно различается. Исправленное изображение дает много информации, которую хотят знать биологи».Чтобы получить изображение большого участка ткани, микроскоп может создать и собрать десятки тысяч изображений меньшего объема, каждое из которых требует собственной коррекции адаптивной оптики. «Поэтому очень важно, чтобы эти исправления были определены и применены быстро», — говорит Бетциг. Новый метод хорошо справляется с задачей, обновляя исправления всего за 14 миллисекунд.
А когда микроскоп используется в двухфотонном режиме, адаптивная оптика работает автоматически. «Вам не нужно замедляться или делать что-то другое, — говорит Бетциг. «Это просто происходит на заднем плане, пока вы управляете микроскопом».