Ученым давно нужны более совершенные инструменты для проведения таких измерений в клетках, потому что неправильная укладка белков является основной причиной повреждения тканей. Заболевания, характеризующиеся чрезмерным неправильным сворачиванием белков, поражают миллионы людей во всем мире и включают болезни Альцгеймера и Паркинсона, системные амилоидозы и прионные инфекции («коровье бешенство»), а также общий дефицит ферментов.«Эта новая технология зондов должна привести к лучшему пониманию того, как сворачивать склонные к неправильной укладке белки в клетках», — сказал Джеффри У. Келли, председатель отделения молекулярной и экспериментальной медицины TSRI, профессор химии Литы Анненберг Хейзен и член Skaggs Институт химической биологии ЦНИИ. «Возможность количественного определения сворачивания белка в клетке с помощью этой простой технологии, основанной на флуоресценции, должна ускорить разработку новых методов лечения».
Об исследовании, проведенном Келли и его лабораторией, сообщается в онлайн-выпуске «Слушаний Национальной академии наук» на этой неделе.Глубокие последствия
Неправильно свернутые белки никогда не было легко отличить от их нормально свернутых аналогов, особенно внутри клеток, потому что оба имеют одинаковую последовательность аминокислот. Однако потеря нормально свернутой формы может иметь серьезные последствия — неправильно свернутый белок обычно теряет свою функцию в клетке. Хуже того, неправильная укладка может обнажить «липкие», ранее скрытые части белка, которые вызывают его агрегацию с другими копиями самого себя, что приводит к дисфункции ткани, которая не может легко регенерироваться.
Мутации как с потерей функции, так и с увеличением токсической функции могут привести к заболеванию, часто сокращая продолжительность жизни. Повышение систем сворачивания или емкости сети гомеостаза белков в клетках может предотвратить или устранить неправильную укладку белков.
Эти новые зонды позволяют ученым количественно оценить, как адаптация сети гомеостаза белка улучшает сворачивание конкретного белка.В новом исследовании команда Келли стремилась выборочно пометить только свернутые и функциональные конформации интересующего белка.
В одном случае, чтобы продемонстрировать доказательство принципа, ученые использовали модельный белок, ретроальдолазу, разработанный фермент, созданный сотрудником лаборатории Дэвида Бейкера в Вашингтонском университете в Сиэтле. Команда также использовала транстиретин (TTR), белок, неправильное сворачивание и агрегация которого, как известно, приводит к нескольким смертельным заболеваниям, включая кардиомиопатии и полинейропатии. (Лаборатория Келли недавно помогла разработать первую специфическую лекарственную терапию полинейропатий TTR.)Команда — в частности, три ведущих автора, аспиранты Ю Лю и Юн Лей Тан и научный сотрудник Синь Чжан — выполнили реакцию маркировки, разработав и изготовив «складывающиеся зонды», которые ковалентно маркируют правильно свернутые функциональные формы белков. но не неправильно сложенные формы.
Когда ученые добавили раствор молекул зондов к растворимому содержимому клеток, содержащих целевые белки, они смогли количественно определить свернутые целевые белки по свету, излучаемому флуоресцентными маяками зондов.На пути к лучшему контролю за новыми лекарствамиЗонды, которые ковалентно реагируют со свернутыми и функциональными семействами белков, были разработаны ранее лабораторией Cravatt в TSRI. Однако их полезность в качестве зондов для сворачивания была подвергнута сомнению научным сообществом, поскольку сам акт реакции зонда-сворачивания с целевым свернутым и функциональным представляющим интерес белком стабилизирует это состояние и обычно увеличивает популяцию свернутой и функциональной фракции. чрезмерное представление его.
В новом исследовании, однако, исследователи использовали сворачивающие зонды в сочетании с лизисом клеток и истощением АТФ, что заставляет шапероны в клетке удерживаться на развернутом протеоме, предотвращая его сворачивание, обеспечивая моментальный снимок свернутого протеина. интересующей совокупности, сводя к минимуму чрезмерную репрезентативность этого состояния в процессе мечения.Одним из наиболее важных применений новых зондов, подобных этим, будет быстрый, «высокопроизводительный» скрининг очень больших библиотек лекарственных соединений для выявления кандидатов в лекарства, которые предотвращают неправильную укладку белков за счет улучшения качества клеточной укладки. «Используя эти зонды для количественной оценки концентрации интересующего функционального свернутого белка, мы можем проводить скрининг, например, на соединения, которые повышают эту концентрацию», — сказал Чжан, который вместе с Келли разработал и разработал исследование.
В этом исследовании исследователи преодолели еще одно препятствие для использования зондов в экранах с высокой пропускной способностью, разработав зонд, чей флуоресцентный маяк не горит постоянно, а включается только тогда, когда он вступает в реакцию со свернутым белком. интерес. «Этот флуоресцентный сигнал быстро показывает концентрацию свернутого функционального белка, который был в клетке во время лизиса», — сказал Чжан. «Нет необходимости в длительном удалении флуоресцентных зондов, которые не связаны с мишенями, или в разделении конъюгата зонд-белок-представляющий интерес».Лекарства, которые уменьшают неправильную укладку определенных белков за счет изменения клеточной биологии белкового гомеостаза, однажды могут быть использованы для предотвращения или отсрочки возрастных нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и Паркинсона, а также для лечения наследственных нарушений ферментной недостаточности.
Чжан, Келли и их коллеги подозревают, что препараты против неправильного свертывания могут иметь еще более широкое применение, учитывая удивительно большие популяции неправильно свернутых белков в клетках и все способы, которыми эти неправильно свернутые белки могут причинять вред.