Используя передовую технику секвенирования для картирования и анализа повреждений ДНК, ученые продемонстрировали функции в бактериальных клетках двух важных белков эксцизионной репарации: Mfd и UvrD.«Биохимические механизмы этих белков были известны в течение многих лет из экспериментов с очищенным белком и ДНК, и это очень важно, но в этой новой работе мы прояснили роль этих белков в живых клетках», — сказал соавтор исследования Кристофер П. Селби, доктор философии, доцент кафедры биохимии и биофизики UNC.«В конечном счете, это лучшее понимание репарации бактериальной ДНК может быть полезно для разработки антибактериальных препаратов», — сказал соавтор исследования Азиз Санкар, доктор медицинских наук, профессор биохимии и биофизики Университета Калифорнии Сары Грэм Кенан.Исследование публикуется на этой неделе в Proceedings of the National Academy of Sciences.
Санкар был удостоен Нобелевской премии по химии 2015 года за свои исследования в 1980-х и начале 1990-х годов по эксцизионной репарации в бактериях и клетках человека. Этот процесс восстановления, который также происходит в клетках животных, устраняет одну из наиболее распространенных форм повреждения ДНК: объемный аддукт, нежелательную химическую модификацию ДНК, обычно вызываемую токсином или ультрафиолетовым (УФ) излучением.
Для изучения эксцизионной репарации в клетках Санкар, Селби и его коллеги недавно разработали новую технику XR-seq, которая позволяет исследователям выделять и секвенировать небольшие участки ДНК, поврежденной аддуктом, которые отрезаются от генома во время процесса эксцизионной репарации.
Знание последовательностей этих фрагментов ДНК позволяет точно отобразить их местоположение в геноме. Впервые они использовали этот метод в 2015 году для создания УФ-карты восстановления генома человека, а в 2016 году они использовали метод XR-seq для создания карт повреждений и восстановления противоопухолевого препарата цисплатин для всего человеческого генома. Теперь они применили этот метод, чтобы ответить на некоторые фундаментальные вопросы о восстановлении повреждений в кишечной палочке с потенциалом разработки новых антибиотиков.Не наклейка: Mfd
В этом исследовании, которое также возглавлял научный сотрудник постдокторантуры Огун Адебали, доктор философии, исследователи в основном сосредоточились на Mfd, белке, который, согласно предыдущей работе Санкара и Селби, играет особую — и механически необычную — роль в эксцизионной репарации в бактерии.«Я думаю, что Mfd — самый интересный белок в кишечной палочке», — сказал Селби.
И вот почему: когда ДНК бактериального гена транскрибируется в РНК, и молекулярный механизм транскрипции застревает в громоздком аддукте, на сцене появляется Mfd, привлекает другие репарационные белки, которые отрезают поврежденный участок ДНК, и " открепляет аппарат транскрипции, чтобы он мог возобновить свою работу. Этот процесс, управляемый Mfd, называется репарацией, связанной с транскрипцией, и он обеспечивает гораздо более высокую скорость эксцизионной репарации на нитях ДНК, которые активно транскрибируются.
Используя XR-seq для картирования УФ-индуцированных повреждений в клетках бактерий E. coli, исследователи обнаружили явные доказательства связанной с транскрипцией репарации в нормальных клетках, но не в клетках, в которых отсутствует Mfd, тем самым подтверждая роль белка в этом процессе.
Разматыватель: УВРДВ дальнейших экспериментах исследователи определили роль дополнительного белка эксцизионной репарации в E. coli — UvrD, который помогает очистить каждый вырезанный сегмент поврежденной ДНК.В отсутствие UvrD вырезанный фрагмент ДНК остается связанным с хромосомной ДНК, что затрудняет его измельчение ферментами по утилизации клеточных отходов.
В то же время репарационные белки, которые иссекали нить, имеют тенденцию оставаться на ней и, таким образом, не могут двигаться дальше, чтобы вырезать другие части поврежденной ДНК. Задача UvrD состоит в том, чтобы раскручивать эти поврежденные и выброшенные цепи из хромосомной ДНК, чтобы от них можно было быстро избавиться, а связанные с ними репарационные белки могли продолжать катализировать дополнительные раунды репарации.Используя XR-seq на поврежденных УФ-излучением клетках E. coli, команда UNC подтвердила, что без UvrD вырезанные фрагменты ДНК остаются прикрепленными к хромосомной ДНК, гораздо дольше выживают в клетках и, удерживая белки эксцизионной репарации, замедляют процесс восстановления. общая скорость эксцизионной репарации в клетках.
Помимо выяснения роли Mfd и UvrD, исследование в целом предвещает использование новой техники XR-seq для картирования и изучения процессов эксцизионной репарации.«XR-seq предоставляет новый тип данных о последовательности, и в этой работе мы впервые предоставили полногеномную карту эксцизионной репарации у бактерии», — сказал Адебали. «Мы думаем, что эта карта будет широко полезна для научного сообщества».
Теперь исследователи планируют дальнейшие исследования с использованием XR-seq в бактериальных клетках, а также в клетках человека и других млекопитающих, где процесс эксцизионной репарации менее изучен.