Инженеры-биологи из Массачусетского технологического института продемонстрировали, что новый метод редактирования генома под названием CRISPR может разрушить единственный ген паразита с вероятностью успеха до 100 процентов — всего за несколько недель. «Такой подход может сделать возможным более быстрый анализ генов и ускорить разработку лекарств», — говорит Жакин Найлс, доцент кафедры биологической инженерии Массачусетского технологического института.«Несмотря на то, что мы секвенировали весь геном Plasmodium falciparum, половина из него все еще функционально не охарактеризована. Это около 2500 генов, которые, если бы мы знали, что они делают, мы могли бы подумать о новых терапевтических средствах, будь то лекарства или вакцины», — говорит Найлз, старший автор статьи, описывающей эту технику, в онлайн-выпуске журнала Nature Methods от 10 августа.Ведущий автор статьи — Джеффри Вагнер, недавно получивший докторскую степень и нынешний постдок Массачусетского технологического института в области биологической инженерии.
Аспирант Рэндалл Платт, недавно получивший докторскую степень Стивен Голдфлесс и Фэн Чжан, профессор W.M. Кек, доцент кафедры биомедицинской инженерии, также внес свой вклад в исследование.
Plasmodium falciparum, передаваемый через кровь паразит, переносимый комарами, является причиной большинства из примерно 219 миллионов случаев малярии и 655 000 смертей от малярии в год. Лечение включает хлорохин и артемизин, но паразит становится более устойчивым к этим препаратам.Существует острая необходимость в разработке новых лекарств, но потенциальные генетические мишени трудно идентифицировать.
У таких животных, как мыши, обычным делом является изучение функций генов путем удаления целевого гена или замены его искусственным фрагментом ДНК. Однако у Plasmodium falciparum этот подход может занять до года, поскольку он основан на гомологичной рекомбинации, типе генетического обмена, который клетки используют для восстановления поврежденных цепей ДНК. Это очень редко встречается в геноме малярийного паразита.«Вы должны полагаться на этот действительно неэффективный процесс, который происходит только в том случае, если у вас есть спонтанные разрывы цепей ДНК, которые попадают в область вашего интереса», — говорит Найлз.
Используя этот трудоемкий подход, ученые смогли определить функции некоторых генов, необходимых паразиту для вторжения в эритроциты, а также некоторых генов, необходимых для того, чтобы паразит позже вырвался из клеток крови. Совсем недавно исследователи успешно использовали ферменты, называемые нуклеазами цинковых пальцев, для вырезания определенных генов, но этот подход является дорогостоящим, поскольку требует разработки новой нуклеазы для каждой генной мишени.CRISPR, система редактирования генов, разработанная за последние несколько лет, использует набор бактериальных белков, которые защищают микробы от вирусной инфекции. Система включает в себя фермент, расщепляющий ДНК, Cas9, связанный с короткой направляющей цепью РНК, которая запрограммирована на связывание с определенной последовательностью генома, сообщая Cas9, где ее разрезать.
Этот подход позволяет ученым нацеливать и удалять любой ген, просто изменяя последовательность направляющей цепи РНК.Как только исследователи успешно продемонстрировали, что эта система может работать в клетках, отличных от бактерий, Найлз начал думать об использовании ее для управления Plasmodium falciparum. Чтобы проверить этот подход, он и его коллеги попытались использовать CRISPR, чтобы разрушить два гена, kahrp и eba-175, которые ранее были отключены при малярии с использованием традиционных подходов.Ген kahrp производит белок, который заставляет красные кровяные тельца, которые обычно гладкие, приобретать узловатый вид при заражении малярией.
Команде Найлза удалось уничтожить этот ген у 100 процентов паразитов, обработанных системой CRISPR; красные кровяные тельца, инфицированные этими паразитами, оставались гладкими.С помощью eba-175, который кодирует белок, который связывается с рецепторами эритроцитов и помогает паразиту проникать в клетки, исследователи разрушили этот ген у 50-80 процентов паразитов, с которыми манипулировали с помощью системы CRISPR. «Мы считаем, что это победа», — говорит Найлз. «По сравнению с эффективностью, с которой генетика P. falciparum была сделана в прошлом, даже 50 процентов — это довольно много».
Для обеих мишеней исследователи продемонстрировали, что они могут вставить ген протеиновой люциферазы, которая излучает свет, в дополнение к отключению существующих генов.Теперь, когда технология CRISPR прошла валидацию на Plasmodium falciparum, Найлс ожидает, что многие ученые примут ее на вооружение для генетических исследований паразита.
Такие усилия могут раскрыть больше о том, как паразит проникает в эритроциты и размножается внутри клеток, что может создать новые мишени для лекарств и вакцин.«Я думаю, что влияние может быть весьма значительным», — говорит Найлз. «Это снижает барьер на пути к более творческому подходу к тому, как мы проводим эксперименты и какие вопросы мы можем задавать».