Точное измерение количества микроРНК, циркулирующих в крови, является чрезвычайно сложной задачей из-за их короткой длины, схожих последовательностей и низких уровней концентрации. Из-за небольшого количества нуклеотидов традиционные методы обнаружения с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) обязательно должны включать этап лигирования или связывания для получения более длинных комплементарных цепей ДНК. Такая перевязка часто приводит к большим ошибкам.Следовательно, для получения точных измерений обычно требуются большие объемы клинических образцов, но немногие традиционные системы обнаружения могут справиться с этим напрямую без надлежащей подготовки образцов и уменьшения объема.
Группа исследователей в Италии из Istituto Italiano di Tecnologia и Неаполитанского университета имени Федерико II, оба в Неаполе, намеревались разработать простую, сверхчувствительную систему обнаружения флуоресценции поступающих микроРНК, в которой используются микрогели с кодировкой спектра.Как сообщает команда в Biomicrofluidics из AIP Publishing, до сих пор такой подход к обнаружению мультиплексированных штрих-кодов применялся только в трудоемких процедурах наблюдения, что значительно затрудняло его возможную диагностическую эффективность.«Наши технологические достижения основаны на простой реализации считывания представляющих интерес последовательностей микроРНК в реальном времени на микрожидкостной основе с обработкой до нескольких микролитров целевого объема», — пояснил Филиппо Кауса, доцент кафедры промышленной биоинженерии. химии, материаловедения и промышленного производства в Неаполитанском университете имени Федерико II. «Никакой предыдущей амплификации последовательности РНК не требуется, что уменьшает очевидные источники ошибок измерения».
Для этого исследователи сначала исследовали экономичную и биосовместимую неньютоновскую жидкость, чтобы создать оптимальное трехмерное выравнивание микрогелей в центре квадратного стеклянного капилляра.Затем они использовали простую микрофлюидную схему для протекания микрогеля и обеспечения непрерывного измерения сигнала флуоресценции с несколькими длинами волн излучения для обнаружения мультиплексированного штрих-кода.«Мы выбрали микрогели с неперекрывающимися молекулами, излучающими флуоресценцию, предназначенные для различения спектральных штрих-кодов для мультиплексного анализа… и для получения абсолютной количественной оценки последовательностей микроРНК», — сказал Кауса. «Точное выравнивание микрогелей при различных скоростях потока и автоматическая нормализация интенсивности последовательности микроРНК в потоке дает нам возможность получать надежные измерения, аналогичные результатам измерений в состоянии покоя, без какой-либо фундаментальной предварительной обработки образца для измерения».
Чтобы доказать свою концепцию этого мультиплексного спектрального анализа микрогелей в микрожидкостном потоке, команда использовала «разные штрих-коды, соответствующие разным выбросам на определенных длинах волн и интенсивности флуоресценции известной концентрации микроРНК», которая была измерена для калибровки конкретной исследуемой микроРНК. Кауза сказал: «На данный момент девять различных штрих-кодов микрогелей были протестированы в потоке с нашим подходом к обнаружению, и готовится еще больше кодов для их дальнейшего мультиплексирования».В качестве доказательства принципа команда исследовала микроРНК на основе ее значения для патогенеза различных злокачественных опухолей, включая рак простаты, желудка, толстой кишки, груди и легких.«Мы смогли детектировать, подсчитывать и идентифицировать в квази-реальном времени сотни микрогелей (~ 80 микрогелевых частиц в минуту) при объеме образца всего несколько микролитров», — сказал Кауса. «Наша система достигла предела обнаружения микроРНК 202 фемтомоляров в условиях микрожидкостного потока».
Измерения проводились с различными штрих-кодами микрогелей, и один, в частности, был ориентирован на конкретные мишени микроРНК, демонстрируя специфичность анализа для условий мультиплексного измерения.«В потоке была обнаружена концентрация микроРНК 21 0,74 пикомоляра, что соответствует исходному уровню концентрации образца», — сказал Кауса. «На основе таких данных флуоресценции стало возможным абсолютное количественное определение уровня концентрации микроРНК 21».
С точки зрения приложений для системы, поскольку конкретное целевое обнаружение микрогелей можно легко настроить, ее можно применять к широкому спектру различных биомаркеров благодаря структуре штрих-кода.«Пользователи также могут легко настроить скорость считывания специально для любой микроскопической системы», — сказал Кауса. «Это означает, что система откроет новые возможности для биочувствительности частиц в микрофлюидных устройствах».