«В наши дни химики-синтетики могут создать практически любую молекулу, которую только можно вообразить в академической лаборатории», — сказал Бахманн. «Но они не всегда могут производить их дешево или в больших количествах. Используя биоретросинтез, теоретически можно сделать практически любую органическую молекулу из простых сахаров».Использование естественного отбора таким новым способом имеет еще одно потенциальное преимущество. «Нам действительно нужна зеленая альтернатива традиционному подходу к производству химикатов.
Биоретросинтез предлагает метод разработки экологически безопасных производственных процессов, поскольку он основан на ферментах — биологических катализаторах, делающих жизнь возможной — вместо высоких температур и давления, токсичных металлы, сильные кислоты и основания, часто требуемые синтетической химией », — сказал он.Обычно и эволюция, и синтетическая химия идут от простого к сложному. Небольшие молекулы объединяются и модифицируются, чтобы образовать более крупные и сложные молекулы, выполняющие определенные функции.
Биоретросинтез работает в обратном направлении. Он начинается с конечного желаемого продукта, а затем использует естественный отбор для производства ряда специализированных ферментов, которые могут сделать конечный продукт из цепочки химических реакций, которые начинаются с простых, общедоступных соединений.Бахманн получил идею применить естественный отбор в обратном порядке из гипотезы ретроэволюции, предложенной в 1945 году покойным генетиком из Калифорнийского технологического института Норманом Горовицем.
Горовиц предвидел раннюю стадию развития жизни, когда ранние организмы плавали в первобытном супе, богатом органическими веществами. В этой среде представьте, что один из видов находит применение сложному химическому соединению А, которое дает ему конкурентное преимущество. В результате его популяция увеличивается, потребляя все больше и больше соединения A. Все идет хорошо, пока соединение A не становится дефицитным.
Когда это происходит, люди, которые развивают фермент, который позволяет им заменять дефицитное соединение А еще имеющимся в изобилии, получают репродуктивное преимущество и продолжают расти, в то время как те, кто остается зависимым от соединения А, вымирают. И так продолжается до тех пор, пока спустя много поколений выжившие не разработали многоэтапные химические пути для производства молекул, необходимых им для выживания, из молекул, доступных в их среде.
Чтобы проверить ретро-подход Бахмана, химики Vanderbilt сначала определили лекарство, которое они хотели произвести, — в данном случае диданозин, препарат против ВИЧ, продаваемый под торговыми марками Videx и Videx EC, производство которого очень дорогое. Затем они определили похожую молекулу-предшественницу, которая может превращаться в диданозин, когда она подвергается определенному химическому превращению вместе с ферментом, способным производить требуемый тип превращения.После того, как они идентифицировали фермент, исследователи использовали силу естественного отбора, создав тысячи копий гена, который производит фермент, с помощью специальной техники копирования, которая вводит случайные мутации.
Мутантные гены были перенесены в кишечные бактерии E. coli для выработки мутантных ферментов и помещены в разные «лунки». После вскрытия клеток и смешивания содержимого с соединением-предшественником в каждой лунке измеряли количество диданозина. Исследователи выбрали фермент, который произвел наибольшее количество желаемого лекарства, а затем произвели достаточное количество этого оптимизированного фермента для следующего шага.Затем исследователи определили второй предшественник — еще более простую молекулу, которая может быть химически преобразована в первый предшественник — и связанный с ним трансформирующий фермент.
Они снова создали тысячи мутировавших версий гена трансформирующего фермента, вставили их в E. coli, поместили в лунки, вскрыли клетки и смешали содержимое с оптимизированным ферментом и вторым предшественником. В очередной раз они проверили все лунки на предмет препарата против ВИЧ.
Лунка с самым высоким уровнем диданозина была той, в которой мутантный фермент был наиболее эффективен в создании первого предшественника, который затем оптимизированный фермент преобразовал в диданозин. Это дало им второй оптимизированный фермент.
Исследователи провели этот процесс обратного отбора трижды, пока не смогли сделать диданозин из простого и недорогого сахара под названием дидезоксирибоза. Одной из ключевых технических проблем было быстрое определение трехмерных структур ферментов, которые были созданы в процессе эволюции.
Доцент фармакологии Тина Айверсон предоставила эту возможность. Ее команда проанализировала ферменты, полученные в лаборатории после каждого раунда мутагенеза, и определила, как структурные изменения, вызванные мутациями, улучшили способность фермента производить желаемую трансформацию.
Эта информация помогла соавторам выяснить, почему одни мутантные ферменты лучше справляются с производством желаемых соединений, чем другие, что повлияло на их выбор в отношении целевых областей белков-предшественников.Чтобы не усложнять задачу, эксперимент по проверке концепции проводился in vitro, а не на живых клетках. Однако конечная цель — использовать подход к получению искусственных соединений путем ферментации.
В исследовании приняли участие аспиранты Уильям Бирмингем, Кристал Старберд, Тимоти Панозиан и Дэвид Наннеманн.