Но само преимущество культуры, имеющей толщину, также создает проблему: как увидеть все клетки и их связи на всем протяжении культуры. Это проблема, с которой сталкиваются многие биологи, врачи, биоинженеры, разработчики лекарств и другие люди, которые также рассматривают трехмерные культуры как полезный этап, прежде чем перейти к моделям на животных.
«Когда я визуализировал эти ткани, я смог получить только внешний слой или два клеток, и это не очень хорошее представление о том, что происходило внутри сферы», — сказал Бутин.Существуют неэлегантные способы разрезать искусственно созданную трехмерную ткань для визуализации, а затем реконструировать ее, но более заманчивое решение, похоже, могло прийти из одной из химических обработок, изобретенных всего за последние несколько лет, чтобы сделать ткани прозрачными. Но какой из них, если таковой имеется, будет работать с нейронными тканями, сконструированными без каркасов?
Чтобы выяснить это, Бутин и его советник Дайан Хоффман-Ким, доцент кафедры молекулярной фармакологии, физиологии и биотехнологии, решили протестировать три простейших метода: ClearT2, SeeDB и Scale.Их результаты, которые читаются как статья Consumer Reports для лабораторного стенда, теперь опубликованы в журнале Tissue Engineering Part C: Methods.По мнению Бутина, метод ClearT2 оказался явным победителем.
Для ее маленьких шариков нервной ткани — 100 миллионных метра в диаметре — ClearT2 позволил ей видеть флуоресцирующие клетки на всех глубинах резкости и, что важно, не изменил размер ткани. Масштаб сделал ее «нейронные сферы» значительно больше, в то время как SeeDB сделал их меньше и не так сильно улучшил четкость.Поддержание размера культуры ткани важно, потому что Бутин хочет знать физические размеры роста в культуре, такие как аксоны, которые один нейрон может распространяться на другой.
По словам Бутина, в то время как ClearT2 работал в течение 1,5 часов, Scale и SeeDB работали три дня.Она провела еще несколько тестов с ClearT2, в том числе с другими типами здоровых и злокачественных нервных клеток, и ClearT2 продолжал работать хорошо, даже позволяя ей визуализировать внеклеточный матрикс.В статье Бутин и Хоффман-Ким признают, что результаты, полученные с помощью различных методов, могут отличаться для разных образцов, но они ожидают, что для многих «свободных от каркаса» сконструированных трехмерных нервных тканей — тканей, которые растут без дополнительных матричных опор — ClearT2 должно работать хорошо.
Знание этого может открыть путь для многих исследовательских проектов с трехмерными тканями.