Используя свой новый подход, ученые смогли отключить белок на поверхности Т-клеток под названием CXCR4, который может использоваться ВИЧ, когда вирус заражает Т-клетки и вызывает СПИД. Группа также успешно отключила PD-1, белок, который вызвал большой интерес в развивающейся области иммунотерапии рака, поскольку ученые показали, что использование лекарств для блокирования PD-1 побуждает Т-клетки атаковать опухоли.Система CRISPR / Cas9 захватила воображение как ученых, так и широкой публики, поскольку позволяет легко и недорого редактировать генетическую информацию практически в любом организме.
Т-клетки, которые циркулируют в крови, являются очевидным кандидатом для медицинского применения этой технологии, поскольку эти клетки не только находятся в центре многих болезненных процессов, но и могут быть легко собраны у пациентов, отредактированы с помощью CRISPR / Cas9, а затем возвращены. на организм для оказания терапевтического воздействия.Но на практике редактирование геномов Т-клеток с помощью CRISPR / Cas9 оказалось на удивление трудным, сказал Александр Марсон, доктор философии, научный сотрудник UCSF Sandler, старший и соавтор нового исследования. «Редактирование генома Т-клеток человека было серьезной проблемой для этой области», — сказал Марсон. «Таким образом, мы потратили последние полтора года, пытаясь оптимизировать редактирование функциональных Т-лимфоцитов. Есть много потенциальных терапевтических применений, и мы хотим быть уверены в том, что делаем все возможное».Новая работа была проведена под эгидой Innovative Genomics Initiative (IGI), совместной программы Калифорнийского университета в Беркли и UCSF под совместным руководством Дженнифер Доудна из Беркли, доктора философии, и Джонатана Вайсмана, доктора философии, профессора клеточной и молекулярной фармакологии в UCSF и Следователь Медицинского института Говарда Хьюза (HHMI).
Марсон является аффилированным членом IGI.Дудна, профессор химии, клеточной и молекулярной биологии в Беркли и исследователь HHMI, сказал, что это исследование является значительным шагом вперед в использовании возможностей редактирования CRISPR / Cas9 в биологии и медицине человека. «Было здорово участвовать в этом захватывающем сотрудничестве, и я с нетерпением жду возможности увидеть результаты этой работы, которые помогут пациентам в будущем», — сказал Дудна, соавтор новой статьи.Cas9, фермент в системе CRISPR, который делает разрезы в ДНК и позволяет вставлять новые генетические последовательности, обычно вводился в клетки с помощью вирусов или кольцевых фрагментов ДНК, называемых плазмидами.
Затем, на отдельном этапе, в клетки также помещается генетическая конструкция, известная как однонаправленная РНК, которая направляет Cas9 в определенные места в ДНК, где требуются разрезы.Однако до недавнего времени редактирование человеческих Т-клеток с помощью CRISPR / Cas9 было неэффективным, и только относительно небольшой процент клеток успешно изменялся.
И хотя ученые добились определенных успехов в отключении генов путем вставки или удаления случайных последовательностей, они еще не смогли использовать CRISPR / Cas9 для вставки (или «вставки») конкретных новых последовательностей для исправления мутаций в Т-клетках.Как будет опубликовано в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences в течение недели с 27 июля 2015 г., группа во главе с первыми авторами Кэтрин Шуманн, докторантом, научным сотрудником лаборатории Марсона, и Стивеном Лином, доктором наук, докторантом в Лаборатория Дудна решила эти проблемы, упростив доставку Cas9 и однонаправленной РНК в клетки.В лабораторных чашках группа собирала рибонуклеопротеины Cas9, или RNP, которые объединяют белок Cas9 с однонаправленной РНК.
Затем они использовали метод, известный как электропорация, при котором клетки кратковременно подвергаются воздействию электрического поля, которое делает их мембраны более проницаемыми, чтобы быстро доставить эти РНП внутрь клеток.С помощью этих нововведений исследователи успешно отредактировали CXCR4 и PD-1, даже добавив новые последовательности для замены определенных генетических «букв» в этих белках. Затем группа смогла отсортировать клетки, используя маркеры, экспрессируемые на поверхности клеток, чтобы помочь извлечь успешно отредактированные клетки для исследования и, в конечном итоге, для терапевтического использования.
«Мы долгое время пытались ввести Cas9 с плазмидами или лентивирусами, а затем отдельно экспрессировать однонаправленную РНК в клетке», — сказал Шуман. «Использование RNP, созданных вне ячейки, чтобы ячейка отвечала за как можно меньшую часть процесса, имело большое значение».Марсон подчеркнул, что, хотя недавние сообщения о редактировании CRISPR / Cas9 человеческих эмбрионов вызвали споры, Т-клетки создаются заново у каждого человека, поэтому модификации не будут переданы будущим поколениям.
Он надеется, что в будущем в клинике появятся препараты для лечения расстройств, связанных с Т-клетками, которые включают аутоиммунные заболевания, а также иммунодефицитные состояния, такие как «болезнь пузырчатого мальчика» на основе Cas9.«На самом деле существует хорошо проторенная почва, позволяющая вводить модифицированные Т-клетки пациентам.
Есть компании, которые уже занимаются этим и выясняют профиль безопасности, поэтому растет клиническая инфраструктура, которую мы потенциально могли бы использовать по мере того, как мы работаем над более подробной информацией о редактировании генома, "Сказал Марсон. «Я думаю, что Т-клетки, отредактированные CRISPR, в конечном итоге попадут в пациентов, и было бы неправильно не думать о шагах, которые нам нужно предпринять, чтобы добраться туда безопасно и эффективно».
