Лаборатория Райса химического и биомолекулярного инженера Лоры Сегатори разработала сложную схему, которая сигнализирует об усилении деградации белков убиквитиновой протеасомной системой клетки (UPS).Исследование опубликовано сегодня в Интернете в Nature Communications.ИБП необходим для множества фундаментальных клеточных процессов, включая клеточный цикл, восстановление ДНК, иммунный ответ, гибель клеток и деградацию неправильно свернутых и поврежденных белков. Он состоит из нескольких компонентов: молекулы убиквитина, которые маркируют неправильно свернутые белки для деградации, и протеасомы, которые прикрепляются к помеченным белкам и расщепляют их на безвредные пептиды.
Когда в клетке слишком мало протеасом или они не функционируют должным образом, неправильно свернутые белки, которые остаются плавающими в цитоплазме, могут агрегироваться. Эти агрегаты могут образовывать бляшки, что часто наблюдается в мозге людей с нейродегенеративными заболеваниями.
Команда Райса добавила в клетку набор генетических цепей, названных Degradation On — «Deg-On» для краткости. Эти схемы производят зеленый флуоресцентный сигнал, связанный с деградацией ИБП, и позволяют исследователям контролировать протеасомную активность.
«Общая цель — разработать технологию для скрининга молекул, которые могут усилить или активировать деградацию», — сказал Сегатори, T.N. Доцент кафедры химической и биомолекулярной инженерии и доцент кафедры биохимии и клеточной биологии.«Протеасома — это, по сути, большая бочка, которая разворачивает и измельчает неправильно свернутые белки. Мы знаем, как подавить деградацию, но мы хотим найти способы ее активировать, потому что мы думаем, что это будет полезно для предотвращения накопления неправильно свернутых белков и агрегации». которые связаны с развитием ряда заболеваний человека ».
Схема Deg-On связывает протеасомную деградацию сконструированного тетрациклинового репрессора с легко обнаруживаемым флуоресцентным сигналом. Репрессор тетрациклина разработан для работы в качестве субстрата ИБП; он по существу имитирует неправильно свернутый белок.Обычно усиленная деградация ослабляет выходной сигнал, но эта генетическая схема позволяет связать усиленную деградацию с увеличением вывода. Спроектированный репрессор все еще может регулироваться антибиотиком тетрациклином, что позволяет откалибровать систему для обнаружения даже минимальной активации деградации UPS.
Дополнительная синтетическая схема обеспечивает петлю обратной связи, которая обеспечивает самоусиление репрессора, так что добавление тетрациклина дополнительно усиливает сигнал.Команда Райса провела обширное компьютерное моделирование Deg-On, чтобы улучшить его чувствительность и динамический диапазон, прежде чем создавать и тестировать систему на стандартных клетках HeLa. В команду вошли аспирант и ведущий автор Вентинг Чжао, студентка Клэр МакУайт и выпускник Райса Мэтью Бонем в сотрудничестве с Джонатаном Силбергом, доцентом биохимии и клеточной биологии в Райс.
«Мы пришли к идее иметь петлю обратной связи, которая представляет собой петлю самоактивации для репрессора тетрациклина, во втором контуре (улучшенном Deg-On)», — сказал Чжао. «Мы обнаружили, что небольшое увеличение активности UPS вызвало небольшое снижение репрессорного белка TetR. Поскольку TetR активирует свою собственную экспрессию в усиленном Deg-On, флуоресцентный выходной сигнал усиливается, и схема приобретает чувствительность и динамический диапазон».«Работа Вентинга сыграла важную роль в прогнозировании изменений в архитектуре схемы, которые приведут к повышению чувствительности», — сказал Сегатори.
По ее словам, ближайшая цель лаборатории — создать тесты для быстрого обнаружения небольших молекул или генов, которые могут повышать протеасомную активность. «Это поможет нам рационально разработать составы или стратегии, которые могут усилить разложение, не только для изучения и лечения болезней неправильной укладки, но и для множества других применений.«Неправильная укладка и агрегация являются одними из основных проблем в области биоинженерии и биотехнологии.
Они являются узким местом в высокопроизводительном производстве рекомбинантных белков, например, в клетках, созданных для ускорения экспрессии интересующего белка», — сказал Сегатори. .Национальный научный фонд, Фонд Уэлча и Фонд Сида У. Ричардсона через Грант Института Биоинженерии и медицинских инноваций Райса поддержали исследование.
