Когда нервная система развивается, нейроны посылают свои аксоны, чтобы установить связь с другими нейронами. Например, нейрон в спинном мозге растет навстречу привлекательным сигналам, исходящим из вентрального спинного мозга и пересекающим среднюю линию. Передние концы растущих аксонов имеют «конусы роста», которые улавливают сигналы притяжения и отталкивания.
Если сигнал притяжения находится слева, новые части мембраны аксона вставляются в левую сторону конуса роста, что заставляет аксон расти в направлении сигнала притяжения.До сих пор, хотя ученые знали, что сигналы притяжения вызывают высвобождение ионов кальция из накопителей внутри конуса роста, они не знали, как это заставляет новые части аксона попадать в нужную часть конуса роста. «С помощью этих экспериментов, — отмечает руководитель группы Хироюки Камигучи, — мы обнаружили, что миозин-Va является недостающим звеном между Ca2 + и поляризованной мембранной доставкой к конусу роста».
Их поиск недостающего звена начался с двух рецепторов кальция, который высвобождается из эндоплазматической сети конусов роста. Каждый из двух рецепторов — RyR3 и IP3R — связан с разным типом высвобождения кальция из эндоплазматического ретикулума и с ростом аксонов в направлении привлекательных сигналов.
Камигучи объясняет: «Мы предположили, что в обоих случаях кальций обнаруживается одним и тем же сенсором, вызывая экспорт мембранных везикул на одну сторону конуса роста».Чтобы выяснить, что такое общий датчик кальция, команда исследовала структуры двух рецепторов в поисках соответствующих областей. Они обнаружили одну область, которая очень похожа между двумя рецепторами.
Затем они провели эксперименты, чтобы определить, какие белки могут там связываться, и обнаружили, что белок миозин-Va взаимодействует с участками обоих рецепторов.Чтобы проверить, необходим ли миозин-Va для роста аксонов до сигналов притяжения, они вводили in vitro в нейроны пептиды, полученные из области связывания миозина-Va.
Миозин-Va по всему конусу роста затем связывается с этими пептидами вместо рецепторов Ry3 и IP3, и аксоны фактически отталкиваются от сигналов притяжения.Затем команда изучила, как миозин-Va участвует в транспортировке мембранных везикул к конусу роста.
Для этого они флуоресцентно пометили VAMP2 — молекулу, обнаруженную в везикулах, — и наблюдали, что происходит, когда миозин-Va не связывается с рецепторами. Они обнаружили, что экспорт везикул увеличился повсюду, препятствуя росту в правильном направлении.Затем группа использовала фокальный фотолиз, индуцированный лазером, чтобы проверить, могут ли аксоны быть направлены на рост в определенных направлениях без потребности в кальции. Они создали инертные «заключенные в клетки» версии конкурентного пептида и ввели их в клетки.
Затем ультрафиолетовый свет направлялся очень точно на одну сторону конуса роста, разрушая «клетки» на этой стороне и высвобождая пептиды. В результате миозин-Va стал несвязанным только на одной стороне конуса роста, и аксон начал расти на этой стороне.
Камигучи осознает силу этой экспериментальной техники. «Наши пептиды не позволяли аксонам пересекать срединную линию спинного мозга in vivo. Далее мы надеемся использовать опосредованное светом управление динамикой мембраны для управления аксонами in vivo, а также для управления другими клеточными функциями, такими как рост синапсов».