Исследователи Массачусетского технологического института теперь разработали способ доставки компонентов репарации генома CRISPR более эффективно, чем это было возможно ранее, и они также считают, что это может быть безопаснее для использования человеком. В исследовании на мышах они обнаружили, что могут исправить мутировавший ген, вызывающий редкое заболевание печени, в 6 процентах клеток печени — этого достаточно, чтобы вылечить у мышей болезнь, известную как тирозинемия.«Это открытие действительно вдохновляет нас, потому что заставляет думать, что это система репарации генов, которую можно использовать для лечения целого ряда заболеваний — не только тирозинемии, но и других», — говорит Дэниел Андерсон, доцент химического факультета Массачусетского технологического института. Инженер и член Института интегративных исследований рака Массачусетского технологического института им.
Коха и Института медицинской инженерии и науки (IMES).Андерсон — один из ведущих авторов статьи, описывающей результаты, в выпуске журнала Nature Biotechnology от 1 февраля. Вэнь Сюэ, доцент кафедры молекулярной медицины Медицинской школы Массачусетского университета, также является старшим автором.
Ведущий автор статьи — Хао Инь, научный сотрудник Института Коха.Найти и заменитьСистема CRISPR полагается на клеточный механизм, который бактерии используют для защиты от вирусной инфекции. Ранее исследователи использовали эту систему для создания комплексов редактирования генов, состоящих из фермента, расщепляющего ДНК, называемого Cas9, и короткой РНК, которая направляет фермент в определенную область генома, направляя Cas9, где его разрезать.
Когда Cas9 и краткая справочная РНК, нацеленная на ген заболевания, доставляются в клетки, в геноме делается определенный разрез, и процессы репарации ДНК клеток снова склеивают разрез, часто удаляя небольшую часть генома. Однако, если исправленная копия гена также доставляется во время разреза, восстановление ДНК может привести к исправлению гена болезни, навсегда восстановив геном.В 2014 году Андерсон и его коллеги описали первое использование CRISPR для восстановления гена болезни у взрослого животного.
В этом исследовании им удалось вылечить тирозинемию у мышей. Однако для доставки генетических компонентов потребовалась инъекция под высоким давлением, метод, который также может вызвать некоторое повреждение печени.«Это была первая демонстрация использования CRISPR / Cas9 для восстановления генов у взрослого животного», — говорит Андерсон. «Мы были взволнованы этой демонстрацией, но хотели найти способ разработать лекарственную форму ремонтного оборудования, которая была бы и более безопасной, и более эффективной».
Исследователи также хотели увеличить процент клеток, в которых был заменен дефектный ген. В предыдущем исследовании была восстановлена примерно одна из 250 клеток печени, что было достаточно для успешного лечения тирозинемии.
Однако для многих других заболеваний потребуется более высокий процент восстановления, чтобы обеспечить терапевтический эффект.В новом исследовании Андерсон и его коллеги разработали комбинированную систему доставки наночастиц и вируса, чтобы предоставить механизм восстановления CRISPR. Во-первых, они создали наночастицу из липидов и матричной РНК (мРНК), которая кодирует фермент Cas9. Два других компонента — направляющая цепь РНК и ДНК для исправленного гена — были встроены в перепрограммированную вирусную частицу на основе аденоассоциированного вируса (AAV).
Сначала исследователи вводили вирус примерно за неделю до липидных наночастиц, давая клеткам печени время начать производство направляющей цепи РНК и матрицы ДНК. Когда были введены наночастицы, несущие цепь мРНК Cas9, клетки начали продуцировать белок Cas9, но только в течение нескольких дней, потому что мРНК в конечном итоге деградировала.
Этого достаточно для восстановления гена, но предотвращает задержку cas9 в клетках и потенциальное нарушение других частей генома клетки.«Есть некоторые опасения, что если в ваших клетках слишком долго находится Cas9, это может вызвать некоторую геномную нестабильность», — говорит Андерсон. «Мы думаем, что использование наночастиц мРНК обеспечивает дополнительный уровень безопасности, гарантируя, что фермент не присутствует в течение слишком длительного периода времени».Высокая точностьС помощью этого метода примерно в одной из 16 клеток был исправлен ген, что в 15 раз лучше, чем в исследовании 2014 года.
Исследователи также обнаружили, что этот подход приводит к меньшему сокращению нецелевой ДНК, чем методы, в которых ген Cas9 интегрируется в геном клетки.«Мы провели анализ в масштабе генома, и у нас очень высокий уровень воздействия на цель, но почти нет побочных эффектов», — говорит Инь.
Лаборатория Андерсона разработала аналогичные липидные наночастицы, которые сейчас находятся в стадии клинической разработки. Вирусные частицы AAV проходят клинические испытания для других целей, поэтому исследователи с оптимизмом полагают, что этот метод доставки CRISPR может быть использован на людях, хотя необходимы дополнительные исследования.Исследователи подали заявку на получение патента на этот метод, который, по их мнению, может быть использован для лечения широкого спектра заболеваний, особенно печени. «Существует ряд метаболических заболеваний и других заболеваний печени, при которых, если вы исправите мутировавший ген, вы действительно сможете повлиять на здоровье человека», — говорит Андерсон.
«Очень интересно видеть, как наша команда разрабатывает этот новый подход к доставке для CRISPR, который, я считаю, может иметь далеко идущие последствия», — говорит Роберт Лангер, профессор Института Дэвида Х. Коха в Массачусетском технологическом институте и автор статьи.