В результате естественного процесса эволюции мутации ДНК генерируют новые или более эффективные белки. Люди нашли так много альтернативных применений этих молекул — в качестве продуктов питания, промышленных ферментов, противораковых препаратов — что ученые стремятся лучше понять, как создавать варианты белка, предназначенные для конкретных целей.Теперь инженеры Стэнфорда изобрели метод, резко ускоряющий эволюцию белка для этой цели. Эта технология, описанная в Nature Chemical Biology, позволяет исследователям тестировать миллионы вариантов данного белка, выбирать лучший для некоторой задачи и определять последовательность ДНК, которая создает этот вариант.
«Эволюция, выживание наиболее приспособленных, происходит в течение тысяч лет, но теперь мы можем направить белки на эволюцию за часы или дни», — сказала Дженнифер Кокран, профессор биоинженерии, соавтор статьи с Томасом Бэром. , директор Стэнфордского центра фотонных исследований.«Это практичная, универсальная система с широким спектром приложений, которую исследователи сочтут простой в использовании», — сказал Баер.
Объединив ноу-хау Кокрана в области белковой инженерии с опытом Бэра в области лазерного оборудования, команда создала инструмент, который может тестировать миллионы вариантов белка за считанные часы.«Демонстрации впечатляют, и я с нетерпением жду более широкого распространения этой технологии», — сказала Фрэнсис Арнольд, профессор химического машиностроения Калифорнийского технологического института, не участвовавшая в исследовании.
Создание миллиона мутантовИсследователи называют свой инструмент µSCALE, или «Анализ отдельных клеток и лазерная экстракция».«Μ» обозначает предметное стекло с микрокапиллярным стеклом, на котором находятся образцы белка.
Размер и толщина слайда примерно с пенни, но в этом пространстве миллионы капиллярных трубок выстроены как соломинки, открытые сверху и снизу.Сила µSCALE заключается в том, что она позволяет исследователям использовать современные биохимические методы для одновременного проведения миллиона экспериментов с белками, а затем извлекать и анализировать наиболее многообещающие результаты.Сначала исследователи использовали процесс, называемый «мутагенез», для создания случайных вариаций в конкретном гене.
Эти мутации вставляются в партии дрожжевых или бактериальных клеток, которые экспрессируют измененный ген и производят миллионы случайных вариантов белка.Пользователь µSCALE смешивает миллионы крошечных непрозрачных стеклянных шариков с образцом, содержащим миллионы дрожжей или бактерий, и распределяет смесь на микрокапиллярном предметном стекле. Крошечные количества жидкости просачиваются в каждую пробирку, неся отдельные клетки.
Поверхностное натяжение удерживает жидкость и клетку в каждом капилляре.Слайд с миллионами дрожжей или бактерий и производимых ими белков вставляется в устройство µSCALE. Микроскоп с программным управлением изучает каждый капилляр и делает снимки протекающей в нем биохимической реакции.Как только пользователь µSCALE идентифицирует интересующий капилляр, исследователь может направить лазер на извлечение содержимого этой пробирки, не нарушая работу соседей, используя изобретательный метод, разработанный Бэром.
«Гранулы — это то, что делает возможным извлечение», — сказал Баер. «Лазер подает энергию для перемещения шариков, что снимает поверхностное натяжение и высвобождает образец из капилляра».Таким образом, µSCALE опорожняет содержимое одного капилляра на пластину для сбора, где можно секвенировать ДНК изолированной клетки и идентифицировать вариант гена, ответственный за интересующий белок.«Одна из уникальных особенностей µSCALE заключается в том, что она позволяет исследователям быстро изолировать одну желаемую клетку от сотен тысяч других клеток», — сказал Боб Чен, докторант лаборатории Кокрана, который написал программу для изучения и обнаружения интересных признаков. активность белка в пробирках.
Перспективные варианты могут быть собраны и переработаны с помощью µSCALE для дальнейшего развития и оптимизации белка.«Это новый захватывающий инструмент для ответа на важные вопросы о белках», — сказал Кокран, сравнив µSCALE с тем, как высокопроизводительные инструменты для анализа генов позволили исследователям раскрыть ключевые особенности биологии, лежащие в основе болезней человека.Бытие и доказательства
Проект начался пять лет назад, когда Баер и его соавтор Иван Димов разработали первый инструмент. Они показали, как идентифицировать типы клеток в микрокапиллярном массиве и извлекать содержимое одного капилляра с помощью стеклянных шариков и сфокусированного лазера.Около трех лет назад Кокран и Баер объединили свои усилия для разработки µSCALE для белковой инженерии, и команда разработала три эксперимента, чтобы продемонстрировать полезность и гибкость µSCALE.В одном эксперименте исследователи проанализировали библиотеку белков, продуцируемых дрожжевыми клетками, чтобы выбрать антитела, которые наиболее прочно связываются с раковой мишенью.
Известно, что антитела с высокой аффинностью связывания мишени эффективны против рака.Во втором примере они разработали ярко-оранжевый флуоресцентный белковый биосенсор.
Используя µSCALE, они сделали это почти в 10 раз быстрее, чем предыдущие методы. Такие биосенсоры часто используются в качестве меток в самых разных биологических экспериментах.
В третьем эксперименте, проведенном профессором биохимии Стэнфордского университета Даниэлем Хершлагом, использовалась функция µSCALE для улучшения модельного фермента.«Эта система позволит нам исследовать эволюционные и функциональные отношения между ферментами, направляя разработку новых ферментов, которые могут выполнять новые полезные реакции», — сказал Хершлаг.