Чувствительные к кальцию флуоресцентные молекулы, называемые GCaMP, излучают флуоресцентный сигнал, указывающий на нейронную активность, и полезны для отслеживания динамики нейронных сетей. Но их сигнал носит временный характер, и если исследователи упускают его из-за того, что микроскоп не фокусируется на нужном участке мозга, информация теряется. С помощью CaMPARI исследователи могут визуализировать нервную активность за пределами ограниченного поля зрения микроскопа, делая снимок нейронной активности на широких участках ткани мозга.
Новый инструмент также позволяет ученым визуализировать нервную активность во время более сложного поведения, чем предыдущие индикаторы кальция, потому что во многих случаях его можно использовать, когда животные свободно перемещаются, а не прикованы к чашке или погружены в агар.«Самым полезным в этой технологии может быть то, что вам не нужно держать свой организм под микроскопом во время эксперимента», — говорит Лорен Лугер, руководитель группы и химик-протеин в Janelia, который разрабатывает инструменты для изучения мозга. «Итак, теперь мы можем визуализировать нейронную активность личинок мух, ползающих по тарелке, или рыб, плавающих в тарелке».Лугер, Эрик Шрайтер и их коллеги сообщают о CaMPARI и его способности маркировать активные нейронные цепи у дрозофил, рыбок данио и мышей в выпуске журнала Science от 13 февраля 2015 года.Шрайтер, старший научный сотрудник лаборатории Лугера, руководил разработкой CaMPARI, работая в составе проектной группы Джанелии по генетически-кодируемым нейронным индикаторам и эффекторам (GENIE).
GENIE — это междисциплинарная команда, занимающаяся разработкой флуоресцентных сенсоров, которые облегчают визуализацию активности нейронов в живых организмах. Проектные группы похожи на небольшие начинающие компании внутри Janelia и созданы для решения биологических проблем, требующих сотрудничества нескольких лабораторий.Чтобы сделать CaMPARI, команда начала с флуоресцентного белка под названием Eos.
Eos излучает зеленую флуоресценцию до тех пор, пока не подвергается воздействию фиолетового света, который навсегда изменяет белок, так что он флуоресцирует красным цветом. «Это была идеальная отправная точка», — говорит Шрайтер. «Это преобразование из зеленого в красный дает нам постоянный сигнал. Поэтому нам просто нужен был способ связать это преобразование с активностью, происходящей в клетке». Для этого ученые включили кальций-чувствительный белок, известный как кальмодулин, который делает изменение цвета зависимым от выброса кальция, сопровождающего нервную активность.
Это тот же домен, который ученые добавили к флуоресцентным белкам, чтобы сделать чувствительные к кальцию сенсоры GCaMP.Чтобы найти полезный белок, который меняет цвет своей флуоресценции только в присутствии кальция и активирующего фиолетового света, исследователи создали и проверили десятки тысяч слегка различных белков. «Когда мы наконец получили тот, который фотопреобразовал больше с кальцием, чем без него, мы знали, что у нас есть инструмент. Нам просто нужно было сделать его лучше, чтобы довести его до такой степени, чтобы другой нейробиолог мог сесть и использовать его», — говорит первый автор Бен Фоск, аспирант по программе биохимии и молекулярной биофизики Чикагского университета.
Команда потратила больше года на настройку своего белка, сделав его ярче и более восприимчивым к кальцию, а также убедившись, что он будет работать в клетках, а затем и в живых мышах, дрозофилах и рыбках данио. В конце концов, у них был инструмент, который они назвали CaMPARI, что означает фотоактивируемый ратиометрический интегратор с кальциевой модуляцией.Необходимость использования фиолетового света для преобразования флуоресценции белка дает экспериментаторам возможность контролировать период времени, в течение которого отслеживается нервная активность. «В идеале, мы можем включить свет, пока животное ведет себя так, как нам небезразлично, а затем выключить его, как только животное перестает вести себя так», — объясняет Шрайтер. «Затем мы делаем снимок только той активности, которая происходит, пока животное ведет себя так».
Ученые провели серию экспериментов, чтобы продемонстрировать эффективность CaMPARI. В одной серии экспериментов они сделали снимок нейронной активности по всему объему мозга рыбки данио в течение 10-секундного периода, когда она плавала в тарелке. После эксперимента CaMPARI был красным в двигательных нейронах, которые, как известно, участвуют в плавании, а также в других ожидаемых наборах нейронов — в соответствии с наблюдениями, сделанными другими учеными во время экспериментов по электрофизиологии. Паттерны активации значительно изменились, когда исследователи изменили температуру или турбулентность воды.
У плодовых мушек команда использовала CaMPARI для определения нейронов, которые активировались в ответ на определенные запахи. И здесь наблюдения были такими, как ожидалось, на основе предыдущих экспериментов: CaMPARI показал, что разные запахи активировали разные наборы нейронов в мухах антенн. В последующей серии экспериментов исследователи экспериментально активировали нейроны, которые непосредственно реагировали на запахи, а затем искали нейроны в других частях мозга, которые впоследствии стали красными. Эти эксперименты выявили нейроны, которые, по словам Шрайтера, могут быть вторичными, третичными или даже четвертичными компонентами обонятельных цепей.
Ученые говорят, что проследить цепь от одного нейрона к другому под микроскопом сложно, потому что проекции клеток и их связи с другими клетками обычно выходят за пределы поля зрения прибора.Ученые ожидают, что при постоянной разработке будущие версии CaMPARI будут более чувствительными и надежными, чем нынешний инструмент.
Но Лугер говорит, что важно немедленно передать CaMPARI в руки нейробиологов. «Идея, вероятно, более мощная, чем инструмент в ее нынешнем виде», — говорит он. «Мы определенно выиграем от того, что пара сотен — надеюсь, тысяча — лабораторий примут CaMPARI и посмотрим, что они могут с ним сделать».С этой целью команда сделала генетическую плазмиду, кодирующую CaMPARI, доступной через репозиторий плазмид Addgene; трансгенные мухи, экспрессирующие CaMPARI, доступны через Bloomington Drosophila Stock Center; и лидер группы Janelia Миша Аренс раздает исследователям данио, экспрессирующих CaMPARI.
По словам ученых, скоро должны появиться инструменты для введения CaMPARI в мышиные клетки.