В новом исследовании, опубликованном на этой неделе в Journal of Biological Chemistry, Олсон и его коллеги Джордж Филлипс, Люсьен Смит и Премила Самуэль сравнили мышечный белок миоглобин у людей, китов и других глубоководных млекопитающих. Миоглобин удерживает кислород для использования внутри мышечных клеток, и исследование показало, что у морских млекопитающих есть сверхстабильные версии миоглобина, которые, как правило, не раскрываются. Исследователи обнаружили, что стабильность была ключом к выработке клетками большого количества миоглобина, что объясняет, почему глубоководные млекопитающие могут загружать свои мышечные клетки гораздо большим количеством миоглобина, чем люди.
«Киты и другие глубоководные морские млекопитающие могут упаковывать в свои клетки в 10-20 раз больше миоглобина, чем люди, и это позволяет им« загружать »кислород непосредственно в свои скелетные мышцы и оставаться активными, даже когда они задерживают дыхание», сказал Олсон, профессор биохимии и клеточной биологии Райс Ральф и Дороти Луни. «Причина, по которой мясо кита такое темное, заключается в том, что оно наполнено миоглобином, способным удерживать кислород. Но когда миоглобин создается заново, он еще не содержит гема. Мы обнаружили, что стабильность миоглобина, не содержащего гема, является ключевым фактором. что позволяет клеткам производить большое количество миоглобина ».
Это важно для Олсона, потому что он хочет создать штамм бактерий, способных производить огромное количество другого белка, который тесно связан с миоглобином. Олсон два десятилетия изучал гемоглобин, более крупный и сложный белок, переносящий кислород в крови. Цель Олсона — создать синтетическую кровь для переливания.
Больницы и травматологи в настоящее время полагаются на донорскую цельную кровь, которой часто не хватает и срок хранения ограничен. Важнейшей частью плана Олсона является максимальное увеличение количества гемоглобина, которое может экспрессировать бактерия.«Наши результаты подтверждают, что стабильность белка является ключевым фактором», — сказал Олсон. «В этом исследовании Премила и Джордж разработали метод in vitro для тестирования экспрессии миоглобина вне живых клеток.
Это позволило нам тщательно контролировать все переменные. Мы обнаружили, что количество экспрессированного полностью активного миоглобина напрямую и сильно зависит от стабильности белка до того, как он связался с гемовой группой ».Все белки имеют характерную форму, а белки семейства глобинов имеют форму вокруг кармана, в котором хранится гем. Гемовый карман открывается и закрывается — так же, как карман бейсбольной перчатки — для улавливания и выпуска кислорода.
Сэмюэл, аспирантка факультета бионаук в Райс, сказала, что безгемовая форма миоглобина, которую она изучала, называется апопротеином или апомиоглобином.«Чем стабильнее апопротеин, тем больше конечного продукта мы сможем получить», — сказала она. «Человеческий апомиоглобин совсем не очень стабилен по сравнению с апоглобином ныряющих млекопитающих, у которых есть версии апоглобина, которые в 60 раз более стабильны, чем наши».
Сэмюэл сказал, что различия в стабильности не очевидны, если просто сравнить общие структуры миоглобина каждого вида. Их общая форма, в том числе форма гемовых карманов, одинакова. Однако из-за тонких различий в их аминокислотных последовательностях более стабильные миоглобины лучше сохраняют свою форму.
Сэмюэл сказал, что эта основная стабильность становится очевидной только при изучении безгемовых или «апо» версий белка. Она измерила стабильность, используя химические вещества, которые заставляли апопротеины разворачиваться.
Тщательно измерив необходимое количество химического вещества, она смогла точно измерить стабильность.Она сказала, что ее работа стала возможной благодаря трем более ранним исследованиям. В 1999 году Эмили Скотт, аспирантка лаборатории Олсона, заметила, что апомиоглобин кашалота гораздо более устойчив к химически индуцированному разворачиванию, чем соответствующие апопротеины человека или свиньи. Скотт задалась вопросом, является ли сопротивление разворачиванию характерной чертой глубоко ныряющих китов, поэтому она собрала образцы у различных млекопитающих и подтвердила эту идею в 2000 году.
В то же время соавтор исследования Смит, еще один аспирант Олсона, изучал каталог 250 мутантных апомиоглобинов кашалотов. Он заметил, что определенный класс мутаций в гемовом кармане приводит к тому, что белки становятся необычайно стабильными, хотя мутации нарушают их способность связывать гем и кислород.
Наконец, в 2013 году Майкл Беренбринк из Ливерпульского университета и Кевин Кэмпбелл из Университета Манитобы отметили, что глубоководные млекопитающие экспрессируют большое количество миоглобина в своей мышечной ткани. Беренбринк и Кэмпбелл систематически проанализировали гены и доступную информацию по всем миоглобинам млекопитающих, включая миоглобины глубоководных видов, и обнаружили, что миоглобины водных млекопитающих имеют большие положительные поверхностные заряды по сравнению с миоглобинами наземных животных.
Они выдвинули гипотезу, что разница в зарядах позволяет водным видам накапливать больше миоглобина в своих мышечных клетках.«Я слышал, как Беренбринк представил свою работу, и я подумал, стоит ли нам заново исследовать работу Эмили и Лучана по уровням экспрессии и стабильности апоглобина», — сказал Олсон. «В то время мы пытались провести скрининг крупномасштабных библиотек мутантов гемоглобина, чтобы попытаться выбрать более высокую стабильность и экспрессию в рамках нашей работы по оценке кровезаменителей. Джордж предложил нам использовать ростки пшеницы. основанная на бесклеточной системе трансляции для этих экранов, и Премила готовилась протестировать методы с миоглобином.
«Мы втроем решили, что она должна провести свои тесты на серии белков, которые включали миоглобины людей, свиней и некоторых глубоководных млекопитающих, которые Эмили проверяла и Беренбринк исследовал», — сказал Олсон. «Мы также использовали результаты доктора философии Люциана для создания трех мутантов, которые были намного более стабильными, чем все, что встречается в природе».В своих тестах Сэмюэл сравнила стабильность и уровень бесклеточной экспрессии миоглобинов у людей, свиней, китов, серых тюленей, кашалотов, карликовых кашалотов и трех мутантов, которые имели низкое сродство к гему, но были в 50 раз более стабильными, чем у кашалотов. апомиоглобины китов.
Исследование подтвердило, что стабильность апопротеина напрямую коррелирует с уровнями экспрессии. Например, очень мало миоглобина свиньи и человека может быть произведено в бесклеточной системе, что дает в 10-20 раз больше миоглобинов кита и мутантов.
По словам Олсона, результаты бесклеточного исследования недвусмысленно подтверждают корреляции экспрессии и стабильности, которые неофициально наблюдались в предыдущей работе как в клетках млекопитающих, так и в E. coli.«Эта работа очень важна для наших проектов по синтетическим кровезаменителям и определению токсичности бесклеточного гемоглобина», — сказал он. «Premila заложила основу для высокопроизводительного скрининга больших библиотек вариантов гемоглобина без необходимости очищать миллиграммы чистого белка.
Этот метод является большим шагом вперед в наших усилиях по выявлению более стабильных рекомбинантных гемоглобинов».