В исследовании, опубликованном в журнале Science, члены института Броуд Фэн Чжан, Джим Коллинз, Деб Хунг, Авив Регев и Пардис Сабети описывают, как этот нацеливающий на РНК фермент CRISPR был использован в качестве высокочувствительного детектора, способного указывать на присутствие всего лишь небольшого количества примесей. как отдельная молекула целевой РНК или молекулы ДНК. Соавторы Омар Абудайе и Джонатан Гутенберг, аспиранты Массачусетского технологического института и Гарварда, соответственно, назвали новый инструмент SHERLOCK (Разблокирование специфического высокочувствительного ферментного репортера); когда-нибудь эту технологию можно будет использовать для реагирования на вспышки вирусов и бактерий, мониторинга устойчивости к антибиотикам и выявления рака.Ученые демонстрируют универсальность метода для различных приложений, в том числе:
Обнаружение наличия вируса Зика в образцах крови или мочи пациента в течение нескольких часов;Различение генетических последовательностей африканских и американских штаммов вируса Зика;
Выявление определенных типов бактерий, таких как кишечная палочка;Выявление генов устойчивости к антибиотикам;Выявление раковых мутаций в моделируемых внеклеточных фрагментах ДНК; а такжеБыстрое считывание генетической информации человека, такой как риск сердечных заболеваний, из образца слюны.
Поскольку инструмент может быть разработан для использования в качестве бумажного теста, который не требует охлаждения, исследователи говорят, что он хорошо подходит для быстрого развертывания и широкого использования внутри и за пределами традиционных условий — например, в полевом госпитале во время вспышки. , или сельская поликлиника с ограниченным доступом к современному оборудованию.«Удивительно, что фермент Cas13a, который был первоначально идентифицирован в нашем сотрудничестве с Юджином Куниным для изучения базовой биологии бактериального иммунитета, может быть использован для достижения такой исключительной чувствительности, которая будет иметь большое значение как для науки, так и для клинической медицины», — сказал Фэн.
Чжан, член основного института Института Броуда, исследователь в Институте исследования мозга Макговерна при Массачусетском технологическом институте, профессор нейробиологии Джеймса и Патрисии Пойтрас 63 года и доцент кафедры мозга, когнитивных наук и биологической инженерии Массачусетского технологического института.В июне 2016 года Чжан и его коллеги впервые охарактеризовали фермент CRISPR, нацеленный на РНК, который теперь называется Cas13a (ранее известный как C2c2), и его можно запрограммировать на расщепление определенных последовательностей РНК в бактериальных клетках. В отличие от ферментов CRISPR, нацеленных на ДНК (таких как Cas9 и Cpf1), Cas13a может оставаться активным после разрезания намеченной РНК-мишени и может проявлять беспорядочное поведение, продолжая разрезать другие нецелевые РНК в результате всплеска активности, который ученые лаборатории Чжана назвали «побочное расщепление». В своей статье и патентной заявке команда описала широкий спектр биотехнологических приложений для системы, включая использование расщепления РНК и побочной активности для фундаментальных исследований, диагностики и лечения.
В статье в Nature в сентябре 2016 года Дженнифер Дудна, Александра Ист-Селецки и их коллеги из Калифорнийского университета в Беркли использовали активность коллатерального расщепления Cas13a для обнаружения РНК. Однако для этого метода требовалось присутствие многих миллионов молекул, поэтому ему не хватало чувствительности, необходимой для многих исследований и клинических применений.
Представленный сегодня метод в миллион раз более чувствителен. Это увеличение стало результатом сотрудничества между Чжаном и его командой и членом института Броуд Джимом Коллинзом, который работал над диагностикой вируса Зика.
В 2014 году Коллинз и его команда из Института Висса создали быстрый синтетический бумажный тест на вирус Эбола, который можно отправлять и хранить при комнатной температуре. Позже они модифицировали систему для обнаружения вируса Зика и продемонстрировали, что им удалось повысить чувствительность датчика, увеличив количество РНК в образце, используя низкие уровни приложенного тепла.Работая вместе, команды Чжана и Коллинза смогли использовать другой процесс амплификации, основанный на тепле тела, для повышения уровня ДНК или РНК в своих тестовых образцах. Как только уровень был увеличен, команда применила второй этап амплификации для преобразования ДНК в РНК, что позволило им повысить чувствительность CRISPR, нацеленного на РНК, в миллион раз, и все это с помощью инструмента, который можно использовать практически в любых условиях.
«Теперь мы можем эффективно и легко создавать сенсоры для любой нуклеиновой кислоты, что невероятно мощно, когда вы думаете о диагностике и исследовательских приложениях», — сказал Коллинз, профессор биоинженерии Термир в Массачусетском технологическом институте и главный преподаватель Института биологической инженерии Висса. в Гарварде. «Этот инструмент предлагает чувствительность, позволяющую обнаруживать чрезвычайно малое количество раковой ДНК в образце крови пациента, например, что поможет исследователям понять, как рак мутирует с течением времени. Для общественного здравоохранения он может помочь исследователям контролировать частоту применения антибиотиков. устойчивые бактерии в популяции. Научные возможности очень быстро становятся захватывающими ».
Одним из наиболее неотложных и очевидных применений этого нового диагностического инструмента станет быстрая диагностика вспышек инфекционных заболеваний в районах с ограниченными ресурсами по месту оказания медицинской помощи.«Эта система вызывает большой ажиотаж», — сказала Деб Хунг, соавтор и содиректор Программы Броуда по инфекционным заболеваниям и микробиому. «Еще многое предстоит сделать, но если SHERLOCK сможет полностью раскрыть свой потенциал, это может коренным образом изменить диагностику распространенных и возникающих инфекционных заболеваний».
«Одна вещь, которая особенно важна в SHERLOCK, — это его способность начать тестирование без большого количества сложных и длительных экспериментальных работ», — сказал Пардис Сабети, также соавтор статьи. После продолжающейся вспышки вируса Зика Сабети и сотрудники ее лаборатории работали над сбором образцов, быстрым секвенированием геномов и обменом данными, чтобы ускорить меры по реагированию на вспышку. «Эта способность брать необработанные образцы и немедленно начинать обработку может изменить диагноз Зика и бесчисленное множество других инфекционных заболеваний», — сказала она. "Это только начало."