В исследовании, опубликованном 6 сентября в Proceedings of the National Academy of Sciences, инженеры и биологи из Принстонского университета отслеживали рост одной бактериальной клетки в зрелую биопленку из 10 000 клеток с упорядоченной архитектурой. Полученные данные должны помочь ученым узнать больше о поведении бактерий и открыть новые способы борьбы с биопленками с помощью лекарств.
«Никто никогда не заглядывал внутрь живой биопленки и не наблюдал, как она развивается клетка за клеткой», — сказала Бонни Басслер, старший автор статьи, профессор молекулярной биологии из Принстона Сквибб, а также исследователь Медицинского института Говарда Хьюза. «Благодаря этой статье мы впервые можем понять, как сообщества бактерий образуют биопленку».Открытие стало возможным благодаря специальному методу микроскопии, впервые примененному в Принстоне бывшим научным сотрудником докторантуры Кнутом Дрешером, который позволил визуализировать отдельные клетки, позволяя исследователям следить за зарождающейся биопленкой в режиме реального времени.
«Мы использовали самую современную технику, чтобы заглянуть в ядро живой, растущей биопленки», — сказал научный сотрудник постдокторантуры Цзин Янь, ведущий автор нового исследования. Наряду с членством в лаборатории Басслера, Ян принадлежит к группе сложных жидкостей, возглавляемой старшим соавтором статьи Говардом Стоуном, профессором Дональда Р. Диксона ’69 и Элизабет У. Диксон, профессором механической и аэрокосмической инженерии в Принстоне. Яна также консультирует старший автор статьи Нед Уингрин, доцент Ховарда А. до профессора естественных наук и исполняющий обязанности директора Института интегративной геномики Льюиса-Сиглера в Принстоне.«Исследование, в результате которого была подготовлена эта статья, находится на стыке материаловедения, инженерии, физики и биологии и представляет собой фантастическое сотрудничество между Принстонским университетом», — сказал Басслер.
Вместе с Яном, Басслером, Стоуном и Вингрином пятым соавтором статьи является Эндрю Шаро, бывший студент факультета физики Принстона, а ныне работающий в Калифорнийском университете в Беркли.Исследователи выбрали холерный вибрион для своей модели организма из биопленок из-за его долгой истории изучения и угрозы здоровью человека, вызывая диарейную болезнь холеру.
Изогнутая палочковидная бактерия V. cholerae живет как свободно плавающая клетка в солоноватой или соленой воде. Когда V. cholerae вступает в контакт с частицей пищи, например, с панцирем краба или креветки, или с клеткой кишечника человека во время болезни, бактерия прикрепляется и начинает размножаться.
Члены расширяющейся колонии выделяют похожее на клей вещество, чтобы не смыть его и защитить себя от конкурирующих бактерий.Предыдущие попытки выяснить, как взаимодействуют клетки в растущей биопленке, потерпели неудачу из-за недостаточного оптического разрешения; в основном то, что делала одна клетка в непрозрачной массе, нельзя было отличить от ее соседей.
Исследователи из Принстона решили эту проблему несколькими способами. Во-первых, они генетически модифицировали бактериальный штамм, чтобы клетки производили белки, которые ярко светятся при освещении определенными цветами света. Выбранные белки обладают самой яркой доступной флуоресценцией, что облегчает выделение каждой клетки и снижает интенсивность потенциально повреждающего клетки света, необходимого для эксперимента.Затем команда использовала конфокальный микроскоп — устройство, которое фокусируется на отдельной части образца с определенного расстояния.
Проведя сотни таких наблюдений, изображения можно сложить вместе, чтобы создать трехмерное изображение всего образца. «Это как заглянуть внутрь биопленки, не разрезая ее», — сказал Ян.
Еще одним стимулом для исследовательской группы стали компьютерные алгоритмы, изначально разработанные для таких областей, как материаловедение. Алгоритмы дифференцировали близко сгруппированные источники света, в данном случае множество сгруппированных клеток V. cholerae в утолщающейся биопленке.
То, что увидела команда из Принстона, было замечательным. Сначала в эксперименте бактериальная колония расширялась горизонтально на заданной поверхности. При расщеплении каждой клетки образовавшиеся дочерние клетки прочно прикрепляются к поверхности вместе со своими родительскими клетками. Однако, сдавленные растущим числом дочерних бактерий, клетки, лежащие в основе расширяющейся колонии, были вынуждены отделяться от поверхности и указывать вертикально.
Таким образом, бактериальная колония превратилась из плоской двумерной массы в расширяющуюся трехмерную каплю, удерживаемую вместе с помощью мусора в развивающейся биопленке.Команда из Принстона немного углубилась в генетику этого клеточного поведения.
Один ген, получивший название RbmA, является ключом к поведению, при котором новые клетки соединяются таким образом, чтобы образовалась трехмерная биопленка. Когда исследователи деактивировали ген, образовалась большая диффузная и гибкая биопленка.
Однако, когда RbmA работал нормально, в результате образовывалась более плотная и прочная биопленка, поскольку клетки оставались связанными друг с другом. Таким образом, RbmA придает биопленке ее устойчивость, обеспечивая понимание потенциальной ахиллесовой пята, которая может быть нацелена на терапевтическое вмешательство.
В настоящее время продолжается работа по измерению физических сил, испытываемых клетками, поднимающимися в центре биопленки, чтобы можно было точно определить общую механику. «В настоящее время мы пытаемся разработать математическую модель того, как бактериальная колония растет во времени и как пространственные особенности связаны с типичными механическими характеристиками биопленки», — сказал Стоун.Исследователи также планируют применить свою новую технику микроскопии для исследования других биопленкообразующих бактерий, стоящих за болезнями человека. Один из примеров: синегнойная палочка, основная причина смертельных инфекций легких у людей с муковисцидозом. Другой патоген — золотистый стафилококк, обычно называемый стафилококком.
Интересно, что механизм образования биопленок этих двух бактерий должен отличаться от V. cholerae. Хотя клетки P. aeruginosa имеют палочковидную форму, как V. cholerae, у них есть выступы, которые помогают им ползать по поверхности. Между тем клетки стафилококка имеют сферическую форму, поэтому их нельзя соединить полюсами.
Методы, изобретенные Яном и его коллегами, могут помочь исследователям-медикам узнать об эффективности лекарств с генетически разными членами одной и той же бактериальной биопленки и с биопленками различной архитектуры. Дальнейшая работа может предложить способы лучше разрушить защитную пленку, чтобы антибиотики могли полностью проникнуть и уничтожить болезнетворные микробы.