«То, что мы делали годами, теперь мы можем достичь за месяцы», — сказал генный исследователь и иммунолог Клаус Раевски, указав на мощь этой новой технологии редактирования генома. CRISPR-Cas9 не только значительно ускоряет исследования — в то же время он намного эффективнее, дешевле и проще в использовании, чем методы, которые использовались до сих пор.
Технология CRISPR-Cas9 позволяет исследователям временно вводить двухцепочечные разрывы ДНК в геном клеток или модельных организмов в выбранных генах. В эти искусственно созданные разрывы цепи они могут вставлять или вырезать гены и изменять генетическое кодирование в соответствии со своими потребностями.Клетки млекопитающих способны восстанавливать повреждения ДНК в своих клетках, используя два различных механизма восстановления. Путь гомологически-направленной репарации (HDR) позволяет вносить заранее запланированные генетические модификации с использованием сконструированных молекул ДНК, которые имеют идентичные участки последовательности с целевым геном и которые распознаются как репарационная матрица.
Таким образом, восстановление HDR очень точное, но происходит только с низкой частотой в клетках млекопитающих.Другая система репарации, называемая негомологичным соединением концов (NHEJ), более эффективна по своей природе, но менее точна, поскольку она легко повторно соединяет свободные концы ДНК без матрицы репарации, тем самым часто удаляя короткие последовательности из генома. Следовательно, репарация NHEJ может использоваться только для создания коротких геномных делеций, но не поддерживает точную модификацию гена или вставку и замену генных сегментов.Многие исследователи, в том числе Ван Трунг Чу, Клаус Раевски и Ральф Кун, стремятся продвигать путь восстановления HDR, чтобы сделать модификацию генов в лаборатории более точной, чтобы избежать ошибок редактирования и повысить эффективность.
Исследователям MDC удалось повысить эффективность более точно работающей системы репарации HDR путем временного ингибирования наиболее доминирующего белка репарации NHEJ, фермента ДНК-лигазы IV. В своем подходе они использовали различные ингибиторы, такие как белки и небольшие молекулы.«Но мы также использовали уловку природы и заблокировали Лигазу IV с помощью белков аденовирусов. Таким образом, мы смогли повысить эффективность технологии CRISPR-Cas9 до восьми раз», — пояснил Ральф Кун.
Например, им удалось вставить ген в заранее определенное положение в геноме (нокаут) более чем в 60% всех манипулируемых клеток мыши. Кун только недавно присоединился к MDC и возглавляет исследовательскую группу по «моделированию заболеваний на основе iPS-клеток».
До прихода в MDC он был научным сотрудником Helmholtz Zentrum Munchen. «Опыт Ральфа Куна очень важен для исследований генов в MDC и особенно для моей исследовательской группы», — сказал Клаус Раевски.Одновременно с публикацией статьи исследователей MDC компания Nature Biotechnology опубликовала еще один документ, связанный с технологией CRISPR-Cas9. Он поступил из лаборатории Хидде Плое из Института Уайтхеда в Кембридже, Массачусетс, США.
Соматическая генная терапия с помощью CRISPR-Cas9 — цельНовая технология CRISPR-Cas9, разработанная в 2012 году, уже используется в лаборатории для исправления генетических дефектов у мышей. Исследователи также планируют изменить генетический набор индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPS), которые можно дифференцировать в специализированные типы клеток или ткани. То есть исследователи могут использовать новый инструмент для введения мутаций, происходящих от пациентов, в геном iPS-клеток для изучения начала заболеваний человека. «Однако еще одна цель на будущее — использовать CRISPR-Cas9 для соматической генной терапии у людей с тяжелыми заболеваниями», — отметил Клаус Раевски.
Клаус Раевски: «Одна из самых горячих тем в биомедицине и инновационной сфере»«Технология CRISPR-Cas9 — одна из самых горячих тем в биомедицинских исследованиях и инновационная область», — сказал Клаус Раевски. Он отметил, что новые возможности точного редактирования генома вызвали интенсивные дебаты в США и других странах, поскольку новые точные инструменты могут также применяться для модификации генома в половых клетках или эмбрионах человека.
Хотя манипулирование зародышевой линией человека запрещено законом во многих странах, включая Германию, глобальный запрет не действует. Исследователи MDC очарованы новыми возможностями, которые система CRISPR-Cas9 предлагает для биомедицинских исследований, но категорически отвергают генетические модификации зародышевой линии человека.