Ральф Юнгманн, доктор философии, выпускник Гарвардского института биологической инженерии Висса и в настоящее время профессор Университета Людвига-Максимилиана (LMU) и Института биохимии Макса Планка (MPI) в Германии и член основного преподавателя Института Висса Пэн Инь , Доктор философии, разрабатывают DNA-PAINT, мощную технологию молекулярной визуализации, которая включает в себя временные взаимодействия ДНК-ДНК для точной локализации флуоресцентных красителей со сверхвысоким разрешением. Однако, хотя исследователи продемонстрировали потенциал DNA-PAINT, визуализировав отдельные биомолекулы, такие как белки, в фиксированных клетках на фиксированном близком расстоянии, эту технологию пока нельзя было применить для исследования молекул глубоко внутри клеток.Теперь команды Юнгмана и Инь сообщают о решении, позволяющем преодолеть это ограничение.
В своем новом исследовании они адаптировали технологию DNA-PAINT для микроскопов, широко распространенных в лабораториях клеточной биологии, называемых конфокальными микроскопами, и которые используются исследователями для изображения целых клеток и более толстых тканей с более низким разрешением. Команда MPI / Wyss Institute демонстрирует, что этот метод может визуализировать множество различных молекул, включая комбинации различных белков, РНК и ДНК по всей глубине целых клеток в сверхвысоком разрешении.
Этот подход, опубликованный в Nature Communications, может открыть дверь для подробных исследований локализации одиночных молекул во многих областях исследования клеток.Подход DNA-PAINT прикрепляет «якорную нить ДНК» к интересующей молекуле. Затем меченная красителем «цепочка визуализатора» ДНК с комплементарной последовательностью временно прикрепляется к якорю и производит флуоресцентный сигнал, который происходит как определенное событие мигания в одиночные молекулярные сайты.Поскольку "мигание" точно настраивается, молекулы, которые находятся на расстоянии всего нанометров друг от друга, могут быть различимы — при более высоком разрешении сверхвысокого разрешения.
«Наш новый подход, SDC-PAINT, объединяет универсальные возможности сверхвысокого разрешения DNA-PAINT с функциями оптического сечения конфокальных микроскопов. Таким образом, мы создали средства для исследования всей глубины клетки и визуализации молекул внутри нее. в нанометровом масштабе ", — сказал Юнгманн. Команда определила наличие различных комбинаций белка в целых клетках, а затем пошла дальше. «Диверсифицируя наши подходы к маркировке, мы также визуализировали различные типы отдельных биомолекул в хромосомосодержащем ядре, включая последовательности в ДНК, белки, связанные с ДНК или мембраной, которая окружает ядро, а также ядерные РНК», — добавляет Инь. который также является соруководителем Инициативы молекулярной робототехники Института Висс и профессором системной биологии в Гарвардской медицинской школе. .В принципе, конфокальные микроскопы используют так называемые точечные отверстия для устранения нежелательной расфокусированной флуоресценции от плоскостей изображения выше и ниже фокальной плоскости.
Сканируя образец, плоскость за плоскостью, исследователи могут собирать сигналы флуоресценции, испускаемые молекулами красителей по всей глубине. В частности, команда MPI / Wyss Institute разработала технику для микроскопов «Конфокальный вращающийся диск» (SDC), которая обнаруживает флуоресцентные сигналы со всей плоскости одновременно, воспринимая их через вращающийся диск с множеством точечных отверстий. Более того, «для достижения трехмерного сверхвысокого разрешения мы разместили дополнительную линзу на пути обнаружения, которая позволяет нам архивировать разрешение, ограниченное субдифракцией, в третьем измерении», — сказал первый автор Флориан Шуедер, аспирант, работающий с Юнгманном, который также работал с командой Yin’s Wyss Institute в рамках своей магистерской диссертации.«Это дополнение может быть легко настроено производителями микроскопов SDC; поэтому мы в основном реализуем микроскопию сверхвысокого разрешения без сложных аппаратных изменений микроскопов, которые обычно доступны клеточным биологам из всех мест проведения биомедицинских исследований. — получение изображений с разрешением по всем клеткам и тканям », — сказал Юнгманн.
«Благодаря этому важному прогрессу микроскопия сверхвысокого разрешения и DNA-PAINT могут стать более доступными для биомедицинских исследователей, что ускорит наше понимание функций отдельных молекул и процессов, которые они контролируют в клетках», — сказал директор-основатель Wyss Institute Дональд Ингбер, доктор медицинских наук, Доктор философии, который также является профессором биологии сосудов в HMS и Программы биологии сосудов в Бостонской детской больнице, а также профессором биоинженерии в SEAS.