Традиционно данные FRAP использовались для измерения молекулярной диффузии — пассивного дрейфа молекул в желеобразной цитоплазме внутри клетки. Но эти молекулярные движения не всегда такие пассивные.
Во многих клеточных процессах молекулы могут активно переноситься молекулярными двигателями, которые тянут молекулы, как локомотивы, тянущие линии грузовых вагонов.«Мы знаем, что активный транспорт важен во многих сотовых системах, но не было никакого способа получить его из данных FRAP», — сказала Вероника Чоканель, доктор философии. студент отделения прикладной математики Брауна. «Мы разработали метод моделирования данных FRAP, который включает в себя активный транспорт и может дать количественную оценку того, как работает эта динамика».В статье, опубликованной в Biophysical Journal, Чоканель и ее коллеги продемонстрировали эту технику, описав новые детали того, как яйцеклетки перераспределяют генетический материал, прежде чем они начнут делиться с образованием эмбриона.Получение большего от FRAP
Чтобы провести эксперимент FRAP, ученые помечают молекулы, которые они хотят наблюдать, светящимися флуоресцентными белками. Затем они поражают интересующую область лазером, который деактивирует некоторые флуоресцентные белки и создает небольшое темное пятно внутри светящейся массы.
Затем ученые наблюдают, как темное пятно рассеивается, что происходит постепенно, когда затемненные молекулы дрейфуют из пятна, а все еще флуоресцентные молекулы дрейфуют внутрь. Количество флуоресценции в пятне с течением времени называется кривой восстановления.Кривая восстановления затем может быть введена в математическую модель, которая генерирует коэффициент диффузии, среднюю скорость, с которой молекулы дрейфуют.
Некоторые модели также могут определять скорость связывания (скорость, с которой молекулы прекращают движение, присоединяясь к какой-либо другой молекуле или субстрату), но не было ни одной, которая могла бы иметь дело с активным транспортом.Чоканель намеревался создать его в сотрудничестве с лабораторией, возглавляемой Кимберли Моури, профессором биологии из Брауна.Активный транспорт в яйцеклетках
Лаборатория Моури изучает локализацию РНК в яйцеклетках или ооцитах. Перед делением с образованием эмбрионов ооциты перераспределяют информационную РНК — важные генетические молекулы — от ядра клетки до внешней мембраны на одной из сторон клетки. Этот процесс происходит у разных видов животных и необходим для нормального развития эмбриона.
Лаборатория Моури изучает это на разновидности лягушек под названием Xenopus laevis, потому что ооциты этого вида относительно большие и их легче наблюдать.Моури и другие исследователи показали, что активный транспорт через молекулярные двигатели, наряду с диффузией, вероятно, важен для процесса локализации в ооцитах Xenopus. Также было предположение, что транспорт от ядра к мембране не был однонаправленным. Моури провел эксперименты, предполагающие, что молекулы мРНК действительно возвращаются к ядру время от времени во время процесса.
Но невозможно было уловить всю эту динамику с помощью FRAP.Работая с Бьорном Сандстеде, председателем отдела прикладной математики Брауна, Чоканель разработал модели с использованием наборов дифференциальных уравнений в частных производных, которые могли улавливать активную динамику. Одна модель захватила два состояния молекулярного движения: простую диффузию, а также активный транспорт в одном направлении.
Вторая, более сложная модель учитывает диффузию, двунаправленное движение, а также возможность того, что некоторые молекулы остаются неподвижными в течение определенного периода времени. Затем Ciocanel разработал ряд численных методов для решения модели и определения скоростей для активного транспортного движения.После того, как модели были созданы и их можно было решить численно, Ciocanel запустил их на синтетических данных FRAP из гипотетической системы, в которой был известен вклад активного транспорта.
Она показала, что модели могут правильно воспроизводить активную динамику на основе синтетических данных.Проверив модели, исследователи применили их к реальным данным экспериментов FRAP на Xenopus и смогли пролить новый свет на процесс локализации РНК.
«Мы смогли количественно оценить вклад каждого из механизмов», — сказал Чоканель. «Мы можем предсказать, какая часть мРНК диффундирует, движется вверх и вниз или останавливается на своем пути».Модели также смогли подтвердить небольшие, но важные нюансы в динамике.
Например, исследование показало, что двунаправленный транспорт происходит более заметно в части клетки, ближайшей к мембране.Подобные новые открытия могут в конечном итоге помочь ученым получить более полную картину динамики этого критического клеточного процесса. Но это далеко не единственная ситуация, в которой методика может быть полезной. Известно, что активный транспорт происходит во многих клеточных процессах.
Например, считается, что синаптическая активность в головном мозге связана с активной локализацией мРНК.«Всякий раз, когда есть активный транспорт, — сказал Сандстеде, — этот метод позволяет вам узнать о том, что происходит».