"Наше создание варианта Cas9, который доводит эффекты от цели до уровней, на которых мы больше не можем их обнаружить, даже с помощью самых чувствительных методов, обеспечивает существенный прогресс в терапевтических приложениях, в которых вы хотите точно поразить цель, не нанося ущерба где-либо. — еще в геноме », — говорит Дж. Кейт Джунг, доктор медицины, доктор философии, заместитель начальника отдела исследований и научный сотрудник Джим и Энн Орр в отделении патологии MGH, старший автор статьи в Nature. «Но его влияние также будет невероятно важным для исследовательских приложений, потому что нецелевые эффекты могут потенциально искажать результаты любого эксперимента. В результате мы предполагаем, что наш высокоточный вариант заменит использование стандартного Cas9 для многих исследований и терапевтических целей. Приложения."
Используемые для создания целевых разрывов ДНК, в которые могут быть внесены генетические изменения, нуклеазы CRISPR-Cas9 объединяют бактериальный ДНК-режущий фермент, называемый Cas9, с короткой направляющей последовательностью РНК, которая может связываться с целевой последовательностью ДНК. Хотя нуклеазы CRISPR-Cas9 проще в использовании, чем предыдущие инструменты для редактирования генов, они имеют хорошо охарактеризованные и существенные ограничения.
Как описано в исследованиях 2013 года, проведенных Joung и другими, нуклеазы CRISPR-Cas9 могут вызывать разрывы ДНК вне мишени в сайтах, которые напоминают последовательность на мишени. Последующие исследования, проведенные командой Чонга и других, уменьшили, но никогда полностью и последовательно не устранили эти нецелевые эффекты.Джунг и его коллеги выдвинули гипотезу, что уменьшение взаимодействий между Cas9 и целевой ДНК может более полно устранить нецелевые эффекты, сохраняя при этом желаемое взаимодействие на-мишени.
Команда MGH сосредоточила внимание на том факте, что определенные части самого фермента Cas9 могут взаимодействовать с основной цепью молекулы ДНК-мишени. Следуя наблюдению, первоначально сделанному со-ведущим автором Викрамом Паттанаяком, доктором медицины, доктором медицины MGH, команда изменила четыре из этих опосредованных Cas9 контактов, заменив длинные боковые цепи аминокислот, которые связываются с основной цепью ДНК, на более короткие, не способные чтобы установить эти связи. «В нашей предыдущей работе было высказано предположение, что Cas9 может связываться с намеченным целевым участком ДНК с большей энергией, чем ему нужно, что делает возможным нежелательное расщепление несовершенно совпадающих участков вне мишени», — говорит Паттанаяк. «Мы рассудили, что, сделав замены в этих четырех позициях, мы могли бы удалить часть этой энергии, чтобы устранить нецелевые эффекты, сохраняя при этом полную активность на цели».
Со-ведущий автор Бенджамин Кляйнстивер, доктор философии из отделения молекулярной патологии MGH, и Мишель Прев, технический специалист в лаборатории Йонга, затем протестировали все 15 возможных вариантов, в которых любая комбинация одной, двух, трех или четырех из этих аминокислотных сторон — цепи были изменены, и было обнаружено, что один вариант с тремя заменами и один вариант с четырьмя заменами, по-видимому, показали наибольшие перспективы в различении несовпадающих сайтов-мишеней, сохраняя при этом полные целевые активности в клетках человека.Затем исследователи более полно охарактеризовали вариант с четырьмя заменами, который они назвали SpCas9-HF1 (Sp для бактерии Streptococcus pyogenes, которая является источником этого широко используемого Cas9, и HF для высокой точности). Они обнаружили, что этот вариант индуцировал целевые эффекты, сравнимые с теми, которые наблюдались с исходным неизмененным SpCas9, при использовании с более чем 85% из 37 различных направляющих РНК, которые они тестировали. Используя GUIDE-Seq, высокочувствительную систему, разработанную лабораторией Юнга в 2014 году для обнаружения нецелевых эффектов CRISPR-Cas9 в геноме, команда обнаружила, что, хотя нуклеазы, объединяющие неизмененный SpCas9 с семью различными направляющими РНК, индуцируют до 25 нецелевых эффектов. мутаций, использование SpCas9-HF1 не дало обнаруживаемых эффектов вне мишени с шестью из этих направляющих РНК и только с одним сайтом вне мишени с седьмой.
Эти результаты были дополнительно подтверждены с помощью целевых экспериментов по глубокому секвенированию.Команда Джунга также обнаружила, что SpCas9-HF1 может снижать нецелевые эффекты при нацеливании на атипичные участки ДНК, характеризующиеся повторяющимися последовательностями из одного или двух нуклеотидов — сайты, которые обычно подвержены множеству мутаций, не соответствующих цели. Они разработали дополнительные производные SpCas9-HF1, названные HF2, HF3 и HF4, которые могли устранить несколько остаточных нецелевых эффектов, которые сохранялись с вариантом HF1 и небольшим количеством направляющих РНК. «Если SpCas9-HF1, использующий определенную направляющую РНК, по-прежнему вызывает несколько нецелевых эффектов, которые особенно трудно устранить, можно разработать новые варианты, которые избавятся даже от этих эффектов», — говорит профессор Джунг. патологии в Гарвардской медицинской школе.
Исследователи также показали, что SpCas9-HF1, как и его естественный аналог, можно комбинировать с другими полезными изменениями, расширяющими его полезность. Предыдущая работа лаборатории Joung, опубликованная прошлым летом в Nature, показала, что введение серии аминокислотных замен может расширить диапазон нацеливания неизмененного SpCas9.
В текущем исследовании авторы показывают, что введение тех же изменений в SpCas9-HF1 также расширило диапазон нацеливания для варианта с высокой точностью воспроизведения. «Эти результаты показывают, что эти варианты должны быть широко полезны для всех, кто в настоящее время использует технологию CRISPR-Cas9», — говорит Кляйнстайвер. «Их можно легко использовать вместо SpCas9 дикого типа и обеспечить высокоэффективный метод снижения нецелевых мутаций до неопределяемых уровней».
