Исследователи считают, что белковый домен, который исследователи определили как главный контроллер разрезания ДНК, является очевидной целью для реинжиниринга, чтобы еще больше повысить точность. Этот подход должен помочь ученым настроить варианты Cas9 — белка, который связывает и разрезает ДНК — чтобы свести к минимуму вероятность того, что CRISPR-Cas9 будет редактировать ДНК в неправильном месте, что является ключевым моментом при проведении генной терапии у людей.
Одна из стратегий повышения точности — создать мутации в управляющем домене белка, называемом REC3, и посмотреть, какие из них улучшают точность, не влияя на эффективность разрезания на цель.«Мы обнаружили, что даже незначительные изменения в домене REC3 Cas9 влияют на разницу между редактированием на и вне мишени, что предполагает, что этот домен является очевидным кандидатом на углубленный мутагенез для улучшения специфичности нацеливания. В качестве расширения этого ", — сказала соавтор исследования Дженис Чен, аспирантка лаборатории Дженнифер Дудна, которая изобрела инструмент редактирования генов CRISPR-Cas9. .Соавторы Чен, Явуз Дагдас и Бенджамин Кляйнстивер и их коллеги из Калифорнийского университета в Беркли, Массачусетской больницы общего профиля и Гарвардского университета сообщают о своих результатах в Интернете перед публикацией в журнале Nature.Сверхточный Cas9
С 2012 года, когда Дудна, профессор молекулярной и клеточной биологии и исследователь Медицинского института Говарда Хьюза в Калифорнийском университете в Беркли, и коллега Эммануэль Шарпантье из Института биологии инфекций Макса Планка перепрофилировали белок Cas9, чтобы создать дешевый, точный и простой в использовании -Используйте редактор генов, исследователи стремились уменьшить шансы нецелевого редактирования. Хотя улучшенная точность воспроизведения приносит пользу фундаментальным исследованиям, она абсолютно необходима при редактировании генов для клинических приложений, поскольку любое нецелевое разрезание ДНК может вывести из строя ключевые гены и привести к постоянным, неожиданным побочным эффектам.
В течение последних двух лет две группы разработали высокоточные белки Cas9 — белки с повышенной специфичностью под названием eSpCas9 (1.1) и высокоточные под названием SpCas9-HF1 — и Чен и Дудна попытались выяснить, почему они режут с более высокой специфичностью, чем белок Cas9 дикого типа из Streptococcus pyogenes широко используется сегодня.В настоящее время исследователи, использующие CRISPR-Cas9, создают однонаправленную РНК (sgRNA) — молекулу РНК, которая включает в себя цепь из 20 рибонуклеиновых кислот, которая дополняет конкретную последовательность ДНК из 20 нуклеиновых кислот, на которую они хотят нацелить, и прикрепляют ее к Cas9. Эта направляющая РНК позволяет Cas9 сосредоточиться на комплементарной ДНК, связываться с ней и разрезать двухцепочечную спираль.
Но комплекс Cas9-sgRNA также может связываться с ДНК, которая не совсем совпадает, что приводит к нежелательному разрезанию вне мишени.В 2015 году лаборатория Дудна обнаружила конформационный переключатель Cas9, который активируется, когда РНК-гид и ДНК-мишень совпадают. Они обнаружили, что только когда РНК и ДНК близко совпадают, трехмерная структура Cas9, в частности, конформация домена нуклеазы HNH, изменяет и активирует ножницы Cas9. Однако процесс, ответственный за зондирование нуклеиновых кислот выше конформационного переключателя, оставался неизвестным.
В текущем исследовании Чен и Дагдас использовали метод, называемый одномолекулярным FRET (резонансный перенос энергии Форстера), чтобы точно измерить, как различные белковые домены в белковом комплексе Cas9-sgRNA, в частности REC3, REC2 и HNH, перемещаются, когда комплекс связывается с ДНК.Сначала они определили, что преимущества специфичности, обеспечиваемые eSpCas9 (1.1) и SpCas9-HF1, могут быть объяснены тем фактом, что порог конформационного переключения HNH был намного выше для этих вариантов Cas9, чем для белка Cas9 дикого типа, в результате чего eSpCas9 (1.1) и варианты SpCas9-HF1 с меньшей вероятностью активируют ножницы при связывании с нецелевой последовательностью.
Затем они обнаружили, что домен REC3 отвечает за определение точности связывания мишени, что затем сигнализирует о вращении домена REC2 наружу, чтобы открыть путь для домена нуклеазы HNH, активируя ножницы. Эта активная конформация Cas9 затем способна расщеплять обе цепи целевой ДНК.
Затем Чен, Дагдас и Кляйнстивер показали, что путем мутации частей REC3 можно изменить специфичность белка Cas9 так, чтобы нуклеаза HNH не активировалась, если направляющая РНК и ДНК-мишень не совпадают очень близко. Им удалось разработать улучшенный сверхточный Cas9, получивший название HypaCas9, который сохраняет свою эффективность в отношении цели, но немного лучше позволяет различать сайты, находящиеся на цели и вне ее, в клетках человека.
«Если вы мутируете определенные аминокислотные остатки в REC3, вы можете настроить баланс между активностью Cas9 на мишени и улучшенной специфичностью; мы смогли найти золотую середину, где имеется достаточная активность на намеченной мишени, но также значительно снижается — целевые события, — сказал Чен.Продолжая исследовать взаимосвязь между структурой, функцией и динамикой Cas9, Дудна и ее команда надеются усовершенствовать белок с исключительной чувствительностью, чтобы надежно и эффективно выполнять различные генетические изменения.
