Недавно опубликованный в Nature Communications документ «Инженерное усиление активности целлобиогидролазы» описывает длительное исследование NREL грибковых целлобиогидролаз (CBH) — ферментов, которые используют гидролиз в качестве основного химического вещества для разложения целлюлозы — Trichoderma reesei (TrCel7A) и Penicillium funiculosum (PfCel7A). ). Годы кропотливых исследований принесли большие плоды: команда смогла лучше понять взаимосвязь между структурой и активностью этих ферментов, чтобы предсказать лучшие места для внесения изменений и улучшений.
Как в природе, так и в промышленных процессах ферменты этого семейства являются одними из самых важных ферментов для расщепления целлюлозы. Предполагаемый завод по производству целлюлозного этанола мощностью 2000 тонн в день может потенциально использовать до 5000 тонн фермента в год, и половина этого коктейля ферментов может быть из этого семейства ферментов. «Последние несколько десятилетий предпринимались попытки понять и улучшить биокатализаторы из этого ключевого семейства ферментов», — сказал Грегг Бекхэм, руководитель группы NREL и старший автор исследования. «Чем эффективнее фермент, тем меньше используется фермент, и, следовательно, процесс дешевле. Однако нам еще предстоит пройти долгий путь, чтобы усовершенствовать возможности прогнозирования."
Затем, в 2005 году, исследователи NREL Майк Химмель, Стив Деккер и Билл Адни обнаружили CBH от другого гриба, PfCel7A, и обнаружили, что он работает на 60 процентов лучше, чем TrCel7A. «Нас удивило то, что этот фермент был намного лучше отраслевого стандарта», — сказал Декер, руководивший задачей после того, как Адни покинул NREL. "За последние несколько лет мы провели множество экспериментов, чтобы убедиться, что это действительно так. Тогда, конечно, мы хотели узнать, почему так лучше."
«Если бы мы могли понять структурные различия, то потенциально могли бы использовать эту информацию для разработки более совершенных ферментов, что, в свою очередь, могло бы помочь снизить стоимость целлюлозного биотоплива и биохимического производства», — сказал Бекхэм. "Учитывая сложность работы с этими ферментами, команде NREL потребовалось семь лет тщательной экспериментальной работы, чтобы разработать инструменты, необходимые для подтверждения того, что на этих двух CBH есть несколько горячих точек, которые можно изменить, чтобы они работали лучше."
По словам Декера: «В то время инструменты для генной инженерии Trichoderma были очень ограничены, но из предыдущей работы мы знали, что у других хозяев были проблемы с экспрессией этих белков. Мы начали с нуля и построили собственный T. reesei штаммов хозяев, векторов и протоколов трансформации и скрининга.
По сравнению с хорошо развитыми системами, такими как E. coli, т. Низкая эффективность трансформации reesei, утомительные процессы отбора, медленный рост и низкий выход белка сделали эту операцию сложной. От разработки до финального тестирования каждого штамма у нас уходили месяцы."
Открытие развернулось, когда NREL внимательно изучил сходства между TrCel7A и PfCel7A, а затем работал над выявлением различий. Оба фермента имеют трехдоменную архитектуру: молекула, связывающая углеводы, которая прикрепляет их к целлюлозе; каталитический домен, разрушающий целлюлозу; и ссылка, которая соединяет эти два домена вместе.
Затем исследовательская группа провела эксперименты по замене домена, создав библиотеку химер, которая представляет собой набор мутантных ферментов, созданных из двух родительских ферментов.
«С тремя доменами между двумя родителями получается восемь комбинаций», — сказал Бекхэм. «Мы протестировали различные комбинации, чтобы выяснить, какая область обеспечивает лучшую производительность фермента, и, возможно, неудивительно, если оглянуться назад, это каталитический домен."
С этими результатами исследователи сравнили каталитические домены TrCel7A и PfCel7A и обнаружили восемь областей, которые были разными.
Продолжая сужать возможности, команда взяла родительский элемент TrCel7A и внесла изменения, по одной в эти восемь областей, и обнаружила две важные модификации, которые привели к тому, что TrCel7A работает почти на уровне родительского элемента PfCel7A.
«Эти два очень маленьких изменения в этом огромном белке в основном удвоили производительность TrCel7A», — сказал Бекхэм. «Исследователи, занимающиеся инженерией белков на этих невероятно сложных ферментах, учатся тому, что в этом каталитическом домене есть очень незначительные изменения, которые можно модифицировать, чтобы резко повлиять на производительность фермента, что делает его способным быстрее расщеплять целлюлозу и, таким образом, позволяет производить промышленные процессы. использовать меньше фермента."
«Мы знали, что открытие PfCel7A было важным в то время, но путь вперед был не совсем ясен», — сказал Химмель, главный руководитель проекта. «В первую очередь мы занялись самым сложным семейством целлюлаз, которое нужно улучшить, и поэтому из этого следует, что ферменты других семейств, разлагающие биомассу, можно сделать максимально активными в более оптимизированном процессе с меньшими затратами на исследования и разработки.
Это было объединение экспериментальной биохимии и вычислительной науки, которое принесло это исследование в Nature Communications, и этот результат стал возможен только при устойчивом финансировании со стороны Управления биоэнергетических технологий."
Конечная цель команды NREL — помочь другим исследователям проанализировать массу данных по геномике, чтобы найти лучшие ферменты, основываясь только на их генетической последовательности. «Через 10 лет было бы так здорово иметь возможность сесть с тысячами ферментных последовательностей из этого семейства и предсказать, какие из немногих следует попробовать», — сказал Бекхэм. "Это исследование — один шаг на очень долгом пути, но это достойная цель."